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如何提升細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)效率?2021/12/22
細(xì)胞轉(zhuǎn)染是細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的一種常用的技術(shù)手段。而轉(zhuǎn)染效率低卻是實(shí)驗(yàn)童鞋們經(jīng)常遇到的問題，尤其是原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染，更是因?yàn)殡y度大，號稱誰碰誰死，而令人談虎色變。不，應(yīng)該是談原代細(xì)胞色變。那么，當(dāng)實(shí)驗(yàn)...
從M13噬菌體模板合成固定長度的單鏈DNA探針2021/12/21
材料與儀器大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段限制性內(nèi)切核酸酶模板DNA寡核苷酸引物乙酸銨DTTEDTA乙醇NaCl酚氯仿TBE電泳緩沖液Tris-ClKlenow基礎(chǔ)緩沖液dNTP溶液變性聚丙烯酰...
差異顯示PCR2021/12/21
材料與儀器反轉(zhuǎn)錄酶熱穩(wěn)定DNA聚合酶錨定3'-寡核苷酸引物隨機(jī)5'-寡核苷酸引物總RNA帶放射標(biāo)記的dATP擴(kuò)增緩沖液DD-PCR反轉(zhuǎn)錄緩沖液DTTdNTP貯存液胎盤RNase抑制劑測序膠上樣緩沖液瓊...
cDNA 3'末端的快速擴(kuò)增（3’-RACE)2021/12/21
原理在用oligo(dT)引物構(gòu)建的cDNA文庫中，偶而發(fā)生部分cDNA克隆缺失了與靶mRNA3'末端互補(bǔ)的序列。這部分序列到底是在cDNA合成過程中還是在分子克隆中怎樣缺失和在哪個(gè)環(huán)節(jié)中缺失的尚不清...
cDNA 5’末端的快速擴(kuò)增（5’-RACE）2021/12/21
原理在分子克隆中沒有比分離缺乏相應(yīng)的mRNA5'末端的序列特征結(jié)構(gòu)的cDNA克隆更易失敗的了。通常存在于cDNA基因文庫中的部分克隆，由于反轉(zhuǎn)錄酶未能沿全長mRNA模板延伸*，合成的cDNA第一條鏈往...
純化的RNA的點(diǎn)雜交和狹線雜交2021/12/21
原理點(diǎn)雜交和狹線雜交技術(shù)（Kafatosetal.1979)用于在同一固相支持物（通常為帶電荷的尼龍膜）上固定幾種核酸樣品，然后用合適的探針與已固定的樣品雜交，并由此判斷靶序列的濃度。通過估計(jì)樣品點(diǎn)發(fā)...
從鼠尾或其他小樣本中制備基因組DNA2021/12/20
原理這一簡單的實(shí)驗(yàn)方案在成百上千的實(shí)驗(yàn)室被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因或基因剔除小鼠的基因型鑒定以及從小量培養(yǎng)的細(xì)胞或組織塊中提取DNA。材料與儀器蛋白酶K培養(yǎng)的細(xì)胞鼠尾或小鼠組織乙醇異丙醇酚氯仿異戊醇磷酸鹽緩沖...
從96孔微培養(yǎng)板生長的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分離DNA2021/12/20
原理本方案由Ramirez-solis等的方法1992，1993改進(jìn)而成，是一種從微培養(yǎng)板的每個(gè)孔生長的真核細(xì)胞抽提基因組DNA的簡便有效的方法。每個(gè)孔產(chǎn)生的基因組DNA足以做數(shù)次聚合酶鏈反應(yīng)（PCR...
CPB沉淀法純化放射性標(biāo)記的寡核苷酸實(shí)驗(yàn)2021/12/20
材料與儀器十六烷基溴化吡啶EDTA-TrisEDTA-Tris-DNA溶液乙醇-乙酸鈉溶液乙醇乙酸鈉TE(pH7.6)或適當(dāng)?shù)念A(yù)雜交液核酸和寡核苷酸純化的原料干冰乙醇浴步驟材料溶液和緩沖液稀釋貯存液至...
從大規(guī)模裂解物中制備λ噬菌體顆粒實(shí)驗(yàn)2021/12/20
原理從大規(guī)模培養(yǎng)物中制備的λ噬菌體，可在高鹽存在下用聚乙二酵(PEG)沉淀的辦法從裂解物中回收得到。殘余的細(xì)胞碎片和PEG可用氯仿抽提。在進(jìn)一步純化之前，建議測定噬菌體制備物的得率。材料與儀器大腸桿菌...
cDNA文庫構(gòu)建2021/12/20
原理cDNA文庫是指某生物某發(fā)育時(shí)期所轉(zhuǎn)錄的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。經(jīng)典cDNA文庫構(gòu)建的基本原理是用Oligo(dT)作逆轉(zhuǎn)錄引物，或者用隨機(jī)引物，給...
乙醇沉淀法2021/12/17
原理DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時(shí),乙醇會奪DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般實(shí)驗(yàn)中,是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合,其乙醇的最終含量占67%左右。因而也可改用...
測定用乙醇固定的 DNA 的含量2021/12/17
原理DNA和RNA在260nm處有一很高的吸收峰，利用這個(gè)原理我們測其OD260，再推算出其濃度。材料與儀器細(xì)胞樣品PBS緩沖液70%乙醇PI液離心機(jī)恒溫箱篩網(wǎng)步驟一、培養(yǎng)細(xì)胞的DNA含量的測定制備單...
BSP克隆測序法2021/12/17
材料與儀器【材料】DNA目標(biāo)片段；【試劑】亞硫酸氫鹽；步驟基因組DNA制備亞硫酸氫鹽修飾DNA純化與回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆測序注意事項(xiàng)1、組織樣本：-20℃或-80℃低溫冰箱中保存，液氮或者干冰運(yùn)輸；...
變性RNA在膜上的轉(zhuǎn)移和固定2021/12/17
原理多數(shù)情況下，為檢測特定的靶mRNA，需先將RNA通過瓊脂糖電泳分離后，再從膠上轉(zhuǎn)移到二維支持物上，（通常用尼龍膜)，再與持異的標(biāo)記探針雜交。正如在Nonhem雜交中討論的情況，實(shí)驗(yàn)者可采用多種試劑...
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