凋亡(apoptosis)或程序性死亡的細(xì)胞一個(gè)形態(tài)學(xué)的顯著特點(diǎn)是染色體DNA以核小體為單位（185 bp）規(guī)律斷裂形成長(zhǎng)度約為n×185bp (n=1,2,3,4…) 的DNA片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示為階梯狀凋亡DNA Ladder，是凋亡細(xì)胞最直觀的特征。
選擇性凋亡DNA Ladder抽提試劑盒 核酸提取

選擇性凋亡DNA Ladder抽提試劑盒 

 

選擇性凋亡DNA Ladder抽提試劑盒  核酸提取

目錄號(hào)：40117

試劑盒組成、儲(chǔ)存、穩(wěn)定性：

注意事項(xiàng)：

為保持活性方便運(yùn)輸，Enzyme B客戶收到時(shí)為凍干粉，收到后加500µl滅菌水（25次）或者1ml滅菌水（50次）溶解后－20 oC保存。Enzyme A和Enzyme B為酶溶液，應(yīng)該避免反復(fù)凍融降低活性，如果要分多次使用，最好按照每次使用量分裝后－20 oC保存。

產(chǎn)品介紹：

凋亡(apoptosis)或程序性死亡的細(xì)胞一個(gè)形態(tài)學(xué)的顯著特點(diǎn)是染色體DNA以核小體為單位（185 bp）規(guī)律斷裂形成長(zhǎng)度約為n×185bp (n=1,2,3,4…) 的DNA片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示為階梯狀凋亡DNA Ladder，是凋亡細(xì)胞最直觀的特征。本試劑盒選擇性從組織和細(xì)胞中分離提取凋亡DNA ladder，通過選擇性分離基因組DNA與凋亡DNA ladder，最大限度的減少了基因組DNA對(duì)凋亡DNA ladder的觀察干擾，因此顯著的提高了檢測(cè)敏感度，反應(yīng)可在微量離心管進(jìn)行，2.5小時(shí)完成，快速方便；無(wú)需有機(jī)抽提，檢測(cè)靈敏度ji高，可從約2000個(gè)凋亡細(xì)胞中檢測(cè)到DNA ladder。推薦起始細(xì)胞量為5～10 × 10⁵ 個(gè)，但投入的細(xì)胞量可在1 × 10⁵ ~ 5 × 10⁶之間變化。原則是總細(xì)胞中應(yīng)含有至少約1～2 × 10⁴個(gè)凋亡細(xì)胞。多于2 × 10⁴個(gè)凋亡細(xì)胞通常可獲得十分清晰的凋亡DNA ladder。本試劑盒也可用于從組織中提取凋亡DNA ladder。但與培養(yǎng)細(xì)胞相比，整體動(dòng)物組織凋亡細(xì)胞出現(xiàn)的時(shí)間、部位、程度等規(guī)律性差往往造成難以準(zhǔn)確取材，可能顯著影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。但只要組織確實(shí)發(fā)生凋亡，有經(jīng)驗(yàn)的用戶也可以使用本試劑盒從組織提取凋亡DNA ladder (參見說明4)。

產(chǎn)品說明:

1. 溴化乙錠染色過度將降低DNA條帶檢測(cè)靈敏度，可用水沖洗凝膠10～30分鐘。如沖洗過頭可再用溴化乙錠復(fù)染?？捎酶`敏的DNA染色劑SYBR Green。也可進(jìn)行丙烯酰胺DNA凝膠電泳和DNA銀染。

2. 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)處理后，凋亡可能僅在某一時(shí)間點(diǎn)或某一干預(yù)強(qiáng)度下最為明顯。需要進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)確定最佳干預(yù)時(shí)間或強(qiáng)度。此時(shí)也可用凋亡小體/hoeschst染色試劑盒(DN1801)快速染色凋亡小體觀察。

3. 推薦起始細(xì)胞量為5～10 × 10⁵ 個(gè)，但投入的細(xì)胞量可在1 × 10⁵ ~ 5 × 10⁶之間變化。原則是總細(xì)胞中應(yīng)含有至少約1～2 × 10⁴個(gè)凋亡細(xì)胞。多于2 × 10⁴個(gè)凋亡細(xì)胞通?？色@得十分清晰的凋亡DNA ladder。六孔板的一個(gè)孔相當(dāng)于一個(gè)35 mm培養(yǎng)皿長(zhǎng)滿后可得到1～10 ×10⁵ 個(gè)細(xì)胞，如果細(xì)胞凋亡發(fā)生率為10%，經(jīng)過處理可得到約1～10 × 10⁴個(gè)凋亡細(xì)胞，應(yīng)該足以獲得清晰的凋亡DNA ladder。反之如果不能從>3 ×10⁶個(gè)細(xì)胞獲得清晰的凋亡DNA ladder，表明其中凋亡細(xì)胞少于1%。此時(shí)增加細(xì)胞用量也難已奏效。

4. 從組織塊提取凋亡DNA ladder。取10～20 mg組織塊放入小玻璃勻漿器，加100～200μl Extraction buffer，上下手動(dòng)勻漿15～20次。取出勻漿液，冰上5～10 min。振蕩10秒。4500 rpm 10分鐘收集上清液并轉(zhuǎn)移到新1.5ml離心管，執(zhí)行提取步驟3。另外一種方法是將30～50mg組織jian碎后在PBS里面勻漿，制成細(xì)胞懸液，離心收集細(xì)胞后接步驟2繼續(xù)執(zhí)行提取。

5. 采用高質(zhì)量瓊脂糖，使用寬度較小和厚度較窄的樣品梳子，制作較薄的瓊脂糖凝膠(厚度約2～4 mm)；用較低的電壓進(jìn)行慢速電泳，將顯著增加凋亡DNA條帶檢測(cè)靈敏度。電泳距離不要太長(zhǎng)，否則將使小的凋亡DNA條帶彌散而降低分辨率。

操作步驟： 

1. 用PBS漂洗細(xì)胞兩遍后微型離心機(jī)500 ×g 4oC 5 min收集5～10 × 10⁵個(gè)細(xì)胞（最好同時(shí)做一個(gè)未凋亡細(xì)胞的對(duì)照）。小心用移液槍吸棄上清，除盡管壁附著液體。

2. 將離心管底部的細(xì)胞沉淀用手指輕輕彈松打散后，加入100µl的Extraction buffer，用振蕩器激烈混合10秒鐘后，1,100～1,600 xg(約3500～4500 rpm)離心5分鐘。

3. 勿觸動(dòng)管底沉淀，將上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管。

4. 沉淀按操作2.方法再重復(fù)一次。

5. 把上清液與操作3.的上清液合并于一起共約200µl，作為粗提取液(含有凋亡DNA片段，未凋亡染色體DNA已經(jīng)通過沉淀去除)。

6. 向粗提取液中加入10% SDS 溶液 20µl后，再加入Enzyme A 20µl，混勻，56℃溫育1小時(shí)。

7. 向上述混合液中加入Enzyme B 20µl，混勻,37℃溫育1小時(shí)，或者直到變得透亮（可過夜）。

8. 向上述混合液中加入Precipitant 130µl后，顛倒混勻，再加入1 ml的乙醇，混勻后- 20℃放置1小時(shí)以上（沉淀凋亡DNA片段）。

9. 至少13000rpm 4oC離心15min，棄上清，加1ml 70％乙醇漂洗一遍后離心，倒去乙醇，并且盡量吸除管壁附著液體。敞開管口，室溫晾干沉淀。

10. 用17µl雙蒸水或TE Buffer充分溶解沉淀，加3µl 6 x DNA凝膠上樣緩沖液震蕩混勻。取全部20µl 上樣或者適量上樣進(jìn)行1% agarose gels電泳。溴化乙錠染色，紫外觀察照相（凋亡發(fā)生率較低時(shí)，添加過量TE Buffer溶解沉淀有可能會(huì)導(dǎo)致濃度太稀，無(wú)法檢出DNA Ladder，因此可減少用量，反之，可增加）。

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