重亞硫酸鹽測(cè)序受限于反應(yīng)條件（Bisulfite處理），導(dǎo)致DNA片段丟失和損壞；而EM-seq（Enzymatic methyl-sequencing）使用的是反應(yīng)條件更加溫和的TET酶，投入低于WGBS的DNA起始量（低至10ng）就能夠獲得更長(zhǎng)DNA片段，產(chǎn)出更高質(zhì)量文庫(kù)，實(shí)現(xiàn)可靠的DNA甲基化檢測(cè)。

EM-seq配合Twist靶向甲基化捕獲探針，能夠捕獲和檢測(cè)基因組中鑒定（包括UCSC、Ensembl、ENCODE等數(shù)據(jù)庫(kù)）的生物學(xué)相關(guān)CpG甲基化區(qū)域，覆蓋率達(dá)84.2%，中靶率高，優(yōu)于傳統(tǒng)亞硫酸氫鹽測(cè)序法，是cfDNA液體活檢甲基化疾病標(biāo)志物的篩選工具。除應(yīng)用于cfDNA樣本的檢測(cè)外，也同樣適用于基因組DNA樣本，是一種高性?xún)r(jià)比且方向研究廣的甲基化檢測(cè)方法。

技術(shù)原理：

使用TET2和氧化增強(qiáng)劑保護(hù)經(jīng)修飾的胞嘧啶，使其免受下游的脫氨基作用。TET2以及氧化增強(qiáng)劑將5mC和5hmC氧化成5caC和5gmC，隨后利用脫氨酶APOBEC對(duì)胞嘧啶進(jìn)行脫氨基處理 (不影響5caC和5gmC)，將未甲基化C轉(zhuǎn)變?yōu)?span>U。

技術(shù)優(yōu)勢(shì)：

?  微量：樣本量要求低至10ng；

?  無(wú)損：DNA更完整，文庫(kù)偏倚減少，比對(duì)率高；

?  精準(zhǔn)：Twist靶向甲基化捕獲探針，可檢測(cè)人基因組上398萬(wàn)個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化狀態(tài)，準(zhǔn)確鑒定差異甲基化區(qū)域。

應(yīng)用場(chǎng)景：

?  甲基化生物標(biāo)志物研究

?  cfDNA甲基化研究

?  隊(duì)列樣本的甲基化檢測(cè)

?  發(fā)育與分化研究

?  疾病的發(fā)生發(fā)展研究

?  腫瘤早篩與溯源

技術(shù)路線(xiàn)：

DNA片段化→文庫(kù)制備→酶法甲基化轉(zhuǎn)化→甲基化組富集→上機(jī)測(cè)序→生信分析

分析內(nèi)容：

送樣要求：

經(jīng)典案例

cfDNA多模式表觀遺傳測(cè)序分析（MESA）用于腫瘤檢測(cè)

Li Y, et al. Multimodal epigenetic sequencing analysis (MESA) of cell-free DNA for non-invasive colorectal cancer detection. Genome Med.

血液中cfDNA的多模式特征可應(yīng)用于癌癥液體活檢，但在技術(shù)上仍然具有挑戰(zhàn)性且成本高昂。此研究開(kāi)發(fā)了多模式表觀遺傳測(cè)序分析（MESA），利用EM-seq或TAPS就可以靈活靈敏地捕獲、整合cfDNA的多模型表觀遺傳信息，包括cfDNA甲基化、核小體占位、核小體模糊性等。對(duì)來(lái)自2個(gè)結(jié)腸癌獨(dú)立臨床隊(duì)列的462個(gè)cfDNA樣本，采用靶向EM-seq進(jìn)行測(cè)序，再結(jié)合MESA分析的新模式，與傳統(tǒng)模式在癌癥檢測(cè)中具有高度互補(bǔ)性。與單模態(tài)模型相比，MESA分析顯著提高了結(jié)腸癌、肝癌和胰腺癌的檢測(cè)準(zhǔn)確性，從cfDNA中捕獲了更多高度互補(bǔ)的表觀遺傳信息，突出了使用多模式表觀遺傳特征進(jìn)行癌癥檢測(cè)的重要性和臨床潛力。

cfDNA靶向EM-seq與MESA分析結(jié)果

（A）cfDNA片段的長(zhǎng)度分布。167bp處的峰值（黑色虛線(xiàn)）與核小體一致。（B） 二核苷酸片段橫跨于147 bp片段和側(cè)翼區(qū)。（C）健康人樣本cfDNA的靶向EM-seq信號(hào)。（D）核小體分布于靶基因TSS和PAS（E）核小體占用情況的聚合系。相對(duì)核小體占有率表示核小體占據(jù)率由繪制區(qū)域的平均值標(biāo)準(zhǔn)化。以上結(jié)果基于隊(duì)列1的60名健康對(duì)照的靶向EM-seq數(shù)據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

①   Vaisvila R,et al.Enzymatic methyl sequencing detects DNA methylation at single-base resolution from picograms of DNA. Genome Res. 2021 Jul;31(7):1280-1289.

②  Li Y, et al.Multimodal epigenetic sequencing analysis (MESA) of cell-free DNA for non-invasive colorectal cancer detection. Genome Med. 2024 Jan 16;16(1):9.