表觀修飾不需要改變DNA序列便能實現(xiàn)對性狀的改變，表觀修飾的改變與基因功能乃至細胞狀態(tài)、發(fā)育、衰老、疾病等存在重要的關聯(lián)。在眾多的表觀遺傳修飾中，是為重要且研究廣泛的修飾之一是DNA甲基化。

由于PCR的擴增過程會消除堿基修飾信息，通過傳統(tǒng)測序技術對其進行檢測需要使用特殊的文庫制備步驟，從而造成核酸損壞，最終導致測序讀長序列非常短。

Nanopore測序是Oxford Nanopore Technologies(ONT)公司開發(fā)的基于納米孔電信號的單分子實時測序技術，DNA雙鏈在馬達蛋白的作用下與錨定在生物膜上的八聚體納米孔蛋白結合并解螺旋。由于生物膜兩測存在電勢差，解旋后的單鏈DNA以一定速率通過納米孔。由于化學性質不同，不同堿基通過納米孔時，會引起不同電信號的變化。通過對這些電信號變化進行檢測和解析，完成序列的實時測定。Nanopore的堿基判讀是依據(jù)其電流信號而產(chǎn)生，因此其判定過程比較復雜。目前Nanopore根據(jù)電流的大小及電流大小的變化情況，通過“遞歸神經(jīng)網(wǎng)絡（Recurrent Neural Network）”的復雜算法對堿基進行判讀。

ONT全基因組甲基化測序原理示意圖如下：

技術優(yōu)勢：

?  長讀長：平均讀長＞10Kbp，長可達2M左右，直接跨越重復序列、高度多態(tài)性區(qū)域等特殊區(qū)域；

?  直接測序：無需PCR擴增，可直接保留并檢測DNA甲基化修飾；

?  全基因組覆蓋：可同時檢測全基因組范圍單堿基的5mC與6mA修飾位點，并給出單堿基的甲基化水平；

?  性價比高：ONT測序成本相對于二代NGS測序技術大幅降低。

實驗策略：

分析內容：

注：個性化分析、多組學關聯(lián)分析請聯(lián)系對接銷售或技術支持

送樣要求：

不同DNA甲基化測序技術比較：

經(jīng)典案例

Engineering selectivity of Cutibacterium acnes phages by epigenetic imprinting

通過表觀遺傳印跡研究痤瘡桿菌(C.acnes)噬菌體的選擇

①  背景

痤瘡桿菌（C.acnes）是一種革蘭氏陽性細菌，是人類皮膚微生物組成員。盡管是豐富的皮膚共生體，但某些成員與常見的炎癥性疾病（如痤瘡）有關。各種C.acnes分支的完整基因組序列可以鑒定推定的甲基轉移酶，其中一些可能屬于保護入侵DNA宿主的限制性修飾（R-M）系統(tǒng)。然而，關于這些系統(tǒng)是否在不同的C.acnes菌株中起作用，目前知之甚少。

②  方法

通過Oxford Nanopore Technologies（ONT）測序分析了六種代表性痤瘡C.acnes菌株的甲基化水平。

③  結論

在菌株KPA171202中確定的DNA共有序列上檢測到6mA修飾，且該R-M系統(tǒng)的重組表達證實了其甲基化活性，而R-M敲除突變體驗證了該菌株甲基化特性的缺失。此外還研究了C. acnes噬菌體（PAD20）殺死各種C. acnes菌株的潛力，并將其特異性的增加與甲基化敏感株獲得的噬菌體DNA甲基化聯(lián)系起來。研究證明R-M缺失菌株中繁殖的噬菌體選擇性地殺死R-M缺失痤瘡敏感分支，而益生菌保持對噬菌體感染的抗性。

ONT測序揭示C. acnes KPA171202的R-M系統(tǒng)IIIB影響PAD20噬菌體感染特性并保護細菌免于裂解。

參考文獻：

①   Kn?dlseder N, et al. Engineering selectivity of Cutibacterium acnes phages by epigenetic imprinting. PLoS Pathog. 2022 Mar;18(3):e1010420.

②   Gouil Q, Keniry A. Latest techniques to study DNA methylation. Essays Biochem. 2019 Dec 20;63(6):639-648.