子宮內(nèi)膜著床失敗是不育的重要原因，但目前對(duì)于其背后的機(jī)制尚不明確，主要是缺乏能夠構(gòu)建有組織的子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)并在體外重現(xiàn)著床過程的技術(shù)。

盡管已經(jīng)有了子宮內(nèi)膜類器官，但它們僅由上皮細(xì)胞構(gòu)成，且其頂端面向內(nèi)部，阻礙了胚泡附著。此外，這些類器官被嵌入在細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）中，這可能阻礙胚泡與上皮細(xì)胞的直接接觸。

(一)構(gòu)建頂端向外的小鼠子宮內(nèi)膜類器官的詳細(xì)步驟

步驟

操作內(nèi)容

培養(yǎng)條件

預(yù)期結(jié)果

1

小鼠子宮組織分離

- 使用膠原酶和DNase I在無Ca2?/Mg2?的PBS中消化30分鐘，37°C水浴，100bpm搖晃

- 用冰冷PBS稀釋至15ml，收集上皮細(xì)胞分?jǐn)?shù)

獲得子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞（EECs）和基質(zhì)細(xì)胞（ESCs）的分離物

2

細(xì)胞培養(yǎng)

- 將分離的細(xì)胞重新懸浮在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，并離心兩次

- 將上皮細(xì)胞分?jǐn)?shù)與基質(zhì)細(xì)胞分?jǐn)?shù)混合，接種到12孔培養(yǎng)板中，每孔1ml擴(kuò)增培養(yǎng)基（不涂任何涂層）

- 37°C，5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第1、3、5天更換培養(yǎng)基

細(xì)胞開始在培養(yǎng)板邊緣向中心自然聚集，形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)

3

聚集體的收集與再接種

- 第3天，用1000μl移液管收集環(huán)狀聚集體到1.5ml管中，通過剪短的200μl移液管吹打分散成小聚集體

- 將小聚集體重新接種到同一培養(yǎng)皿中

EECs傾向于位于外圍，ESCs占據(jù)內(nèi)部

4

轉(zhuǎn)移到低黏附培養(yǎng)皿

- 第7天，將每個(gè)聚集體分別挑出，并在96孔低黏附U型底培養(yǎng)皿中用擴(kuò)張培養(yǎng)基培養(yǎng)

- 每?jī)商旄鼡Q一次培養(yǎng)基

經(jīng)過3天懸浮培養(yǎng)（第10天），類器官形成

5

懸浮培養(yǎng)以促進(jìn)類器官形成

懸浮培養(yǎng)過程中，覆蓋外表面的透明層逐漸增厚，最終包裹整個(gè)聚集體

類器官外層由EECs組成，內(nèi)層由ESCs填充，形成頂端向外的結(jié)構(gòu)

6

激素處理以誘導(dǎo)接受狀態(tài)

使用雌二醇（E2）、cAMP和醋酸甲地孕酮（MPA）處理類器官48小時(shí)

類器官對(duì)激素有響應(yīng)，可模擬體內(nèi)子宮內(nèi)膜的接受狀態(tài)

7

與胚泡共培養(yǎng)

將處理后的類器官與從GFP轉(zhuǎn)基因小鼠獲得的胚泡在低黏附U型底培養(yǎng)皿中共培養(yǎng)

觀察胚泡附著、上皮內(nèi)陷、吞噬作用和侵入等著床過程

（二）頂端向外的細(xì)胞排布是如何實(shí)現(xiàn)的？

2.1 利用細(xì)胞的自組織特性

- 細(xì)胞初始聚集：將子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞（EECs）和基質(zhì)細(xì)胞（ESCs）同時(shí)接種到黏附培養(yǎng)板中，在特定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。從第2天開始，細(xì)胞會(huì)自發(fā)聚集，到第3天形成大型環(huán)狀結(jié)構(gòu)。這種聚集現(xiàn)象是細(xì)胞自組織的初步表現(xiàn)，可能與細(xì)胞間的黏附特性有關(guān)。

- 細(xì)胞類型特異性重排：在第5天，細(xì)胞聚集體內(nèi)部發(fā)生了顯著的細(xì)胞類型特異性重排，EECs傾向于位于聚集體的外圍，而ESCs則占據(jù)內(nèi)部。這種重排是細(xì)胞依據(jù)自身特性進(jìn)行的自我組織過程，可能涉及細(xì)胞間的相互識(shí)別和信號(hào)傳遞。

2.2 懸浮培養(yǎng)促進(jìn)細(xì)胞極性形成

- 透明層的形成與細(xì)胞形態(tài)變化：將細(xì)胞聚集體轉(zhuǎn)移到低黏附U型底培養(yǎng)皿中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。在懸浮培養(yǎng)的前3天，覆蓋聚集體外表面的透明層逐漸增厚并最終包裹整個(gè)聚集體。這個(gè)透明層是由E-鈣黏蛋白陽(yáng)性的EECs組成的上皮細(xì)胞層。同時(shí)，扁平的EECs逐漸變成柱狀細(xì)胞，細(xì)胞高度增加，這表明細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)過程中發(fā)生了形態(tài)變化，以適應(yīng)三維環(huán)境并形成頂端向外的結(jié)構(gòu)。

- 細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的形成：掃描電子顯微鏡（SEM）觀察顯示，懸浮培養(yǎng)后類器官的整個(gè)表面都被光滑的EECs覆蓋，沒有ESCs暴露在外。此外，類器官表面觀察到了微絨毛等頂端結(jié)構(gòu)特征，還發(fā)現(xiàn)了類似pinopodes的大型圓頂狀突起，這些結(jié)構(gòu)在體內(nèi)子宮內(nèi)膜的腔面上皮細(xì)胞中也有表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了EECs的頂端向外取向。

2.3 培養(yǎng)基成分的引導(dǎo)作用

- 特定培養(yǎng)基的使用：在整個(gè)培養(yǎng)過程中，使用了專門為子宮內(nèi)膜類器官培養(yǎng)設(shè)計(jì)的擴(kuò)增培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基含有多種成分，如B27、N2、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒（ITS）、尼克酸胺、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-基礎(chǔ)（FGF-Basic）、Noggin、TGFβ/Alk抑制劑A83-01、R-spondin、WNT3A等，這些成分共同作用，為細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和極性形成提供了必要的信號(hào)和營(yíng)養(yǎng)支持，引導(dǎo)細(xì)胞形成頂端向外的結(jié)構(gòu)。

2.4 培養(yǎng)步驟的協(xié)同作用

- 黏附培養(yǎng)與懸浮培養(yǎng)的結(jié)合：先在普通培養(yǎng)皿中進(jìn)行黏附培養(yǎng)，使細(xì)胞能夠初步聚集并形成一定的組織結(jié)構(gòu)，然后通過分散和重新接種，再轉(zhuǎn)移到低黏附培養(yǎng)皿中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。這種培養(yǎng)方式的轉(zhuǎn)變對(duì)于細(xì)胞的自組織和類器官的成熟至關(guān)重要，黏附培養(yǎng)為細(xì)胞提供了初始的相互作用和組織形成的平臺(tái)，而懸浮培養(yǎng)則為細(xì)胞的進(jìn)一步分化和極性形成提供了三維的空間環(huán)境，使EECs能夠在外圍形成頂端向外的結(jié)構(gòu)，而ESCs則填充內(nèi)部。

（三）本文的創(chuàng)新點(diǎn)

3.1 類器官結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的創(chuàng)新

- 頂端向外的細(xì)胞排布：傳統(tǒng)子宮內(nèi)膜類器官存在基底向外、頂端向內(nèi)的極性，導(dǎo)致胚泡無法在體外附著到上皮細(xì)胞的頂端表面。而原文作者研究開發(fā)的類器官實(shí)現(xiàn)了頂端向外的結(jié)構(gòu)，使E-鈣黏蛋白陽(yáng)性的上皮細(xì)胞位于外部，波形蛋白陽(yáng)性的基質(zhì)細(xì)胞位于內(nèi)部，成功模擬了體內(nèi)子宮內(nèi)膜的細(xì)胞排布，為胚泡附著提供了合適的界面。

- 無需嵌入細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）：以往的類器官通常需要嵌入ECM如Matrigel中進(jìn)行培養(yǎng)，這阻礙了胚泡與上皮細(xì)胞的直接接觸。原文作者研究的類器官無需ECM嵌入，使上皮細(xì)胞暴露，有利于胚泡與上皮細(xì)胞的直接相互作用，更真實(shí)地模擬體內(nèi)環(huán)境。

3.2 著床過程模擬的創(chuàng)新

- 完整著床過程的重現(xiàn)：在體外成功重現(xiàn)了小鼠胚泡著床的全過程，包括胚泡附著、上皮內(nèi)陷、細(xì)胞吞噬（entosis）和胚泡侵入四個(gè)步驟。通過時(shí)間序列成像技術(shù)，實(shí)時(shí)觀察到了這些動(dòng)態(tài)過程，為研究著床機(jī)制提供了直觀的證據(jù)。

- 著床反應(yīng)的準(zhǔn)確模擬：侵入類器官的胚泡衍生細(xì)胞表現(xiàn)出類似于滋養(yǎng)層巨細(xì)胞的形態(tài)和增殖蛋白陽(yáng)性特征，同時(shí)周圍的基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)了蛻膜化標(biāo)記物環(huán)氧化酶2，這表明類器官能夠準(zhǔn)確模擬體內(nèi)著床過程中的滋養(yǎng)層細(xì)胞分化和基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化反應(yīng)。

3.3 類器官形成方法的創(chuàng)新

- 基于細(xì)胞自組織的形成機(jī)制：利用子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞在黏附培養(yǎng)條件下的自發(fā)聚集能力，結(jié)合后續(xù)的懸浮培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)了類器官的自組織形成。這種形成機(jī)制不需要外力干預(yù)，依靠細(xì)胞自身的特性和相互作用，形成了具有特定空間結(jié)構(gòu)的類器官。

- 的培養(yǎng)流程：先將細(xì)胞在普通培養(yǎng)皿中進(jìn)行黏附培養(yǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞自發(fā)聚集形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，再經(jīng)過分散和重新接種，最后轉(zhuǎn)移至低黏附培養(yǎng)皿中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，逐步形成類器官。這一的培養(yǎng)流程有助于細(xì)胞的自組織和類器官的成熟。

3.4 激素響應(yīng)性的創(chuàng)新

類器官對(duì)激素處理有明顯的響應(yīng)，能夠通過調(diào)節(jié)激素水平誘導(dǎo)類器官進(jìn)入胚泡接受狀態(tài)，顯著提高了胚泡的附著和侵入效率。這種激素響應(yīng)性對(duì)于研究著床過程中的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)機(jī)制具有重要意義，也為未來開發(fā)激素治療策略提供了實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

3.5 對(duì)比先前模型的創(chuàng)新

- 克服傳統(tǒng)模型局限性：解決了傳統(tǒng)二維和三維共培養(yǎng)模型在重建子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)和模擬著床過程方面的不足，如無法準(zhǔn)確模擬子宮內(nèi)膜的復(fù)雜結(jié)構(gòu)和細(xì)胞間相互作用等。

- 綜合解決多個(gè)問題：雖然此前有研究分別解決了類器官的一些局限性，但本研究同時(shí)克服了所有關(guān)鍵問題，包括細(xì)胞極性、基質(zhì)細(xì)胞的缺失以及ECM的阻礙等，使類器官在模擬體內(nèi)環(huán)境和著床過程方面更加完善。

(四) 技 術(shù) 展 望

將頂端向外的小鼠子宮內(nèi)膜類器官與Kirkstall Quasi Vivo類器官動(dòng)態(tài)灌流培養(yǎng)系統(tǒng)相結(jié)合：

4.1 提升類器官的生理功能模擬

- 更真實(shí)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交換：Quasi Vivo系統(tǒng)通過動(dòng)態(tài)灌流模擬體內(nèi)血管系統(tǒng)，為類器官提供精準(zhǔn)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)輸送和代謝廢物清除。與傳統(tǒng)的靜態(tài)培養(yǎng)相比，這種動(dòng)態(tài)環(huán)境能更真實(shí)地模擬體內(nèi)子宮內(nèi)膜的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交換過程，使類器官的代謝和功能更接近體內(nèi)真實(shí)狀態(tài)。

- 增強(qiáng)細(xì)胞間和細(xì)胞-基質(zhì)間相互作用：動(dòng)態(tài)灌流產(chǎn)生的流體剪切力可以促進(jìn)細(xì)胞間的信號(hào)傳遞和相互作用，模擬體內(nèi)復(fù)雜的生物力學(xué)環(huán)境。同時(shí)，系統(tǒng)提供的三維培養(yǎng)支持結(jié)構(gòu)有助于類器官維持更好的形態(tài)和細(xì)胞外基質(zhì)的形成，從而增強(qiáng)細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互作用，進(jìn)一步提升類器官的生理功能模擬。

4.2 改善類器官的長(zhǎng)期培養(yǎng)與穩(wěn)定性

- 延長(zhǎng)類器官活性：在靜態(tài)培養(yǎng)條件下，類器官在長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)過程中容易出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)不良、代謝產(chǎn)物積累等問題，導(dǎo)致細(xì)胞活力下降和組織結(jié)構(gòu)破壞。而Quasi Vivo系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)灌流能夠持續(xù)提供新鮮的培養(yǎng)基，及時(shí)清除代謝廢物，有助于維持類器官的長(zhǎng)期活性和穩(wěn)定性，延長(zhǎng)其可使用時(shí)間。

- 促進(jìn)類器官的成熟與分化：動(dòng)態(tài)培養(yǎng)環(huán)境為類器官的成熟和分化提供了更理想的條件。細(xì)胞在持續(xù)的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和適宜的生物力學(xué)刺激下，能夠更好地完成其正常的生理功能和分化過程，使類器官的組織結(jié)構(gòu)和功能更加完善，從而更準(zhǔn)確地模擬體內(nèi)子宮內(nèi)膜的生理狀態(tài)。

4.3 增強(qiáng)類器官與胚泡相互作用的準(zhǔn)確性

- 更精準(zhǔn)的激素調(diào)節(jié)：Quasi Vivo系統(tǒng)可以精確控制培養(yǎng)環(huán)境中的激素濃度和動(dòng)態(tài)變化，模擬體內(nèi)復(fù)雜的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)過程。在研究胚泡著床過程中，通過動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)激素水平，可以更精確地研究不同激素對(duì)胚泡與類器官相互作用的影響，深入了解著床過程中的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)機(jī)制。

- 更真實(shí)的機(jī)械力環(huán)境：系統(tǒng)模擬的體內(nèi)流體環(huán)境所產(chǎn)生的機(jī)械力，如剪切力等，可以影響細(xì)胞的黏附、遷移和分化等過程。在胚泡與類器官相互作用中，這些機(jī)械力可能對(duì)胚泡的附著和侵入等步驟產(chǎn)生重要影響。通過結(jié)合Quasi Vivo系統(tǒng)，可以更好地研究機(jī)械力在著床過程中的作用，為揭示其背后的分子機(jī)制提供新的視角。

4.4 推動(dòng)疾病模型研究與藥物篩選

- 更準(zhǔn)確的疾病模型模擬：在研究子宮內(nèi)膜相關(guān)疾?。ㄈ缱訉m內(nèi)膜異位癥、子宮內(nèi)膜癌等）時(shí)，結(jié)合Quasi Vivo系統(tǒng)的頂端向外小鼠子宮內(nèi)膜類器官可以更準(zhǔn)確地模擬疾病發(fā)生發(fā)展的微環(huán)境。動(dòng)態(tài)灌流培養(yǎng)能夠反映疾病狀態(tài)下復(fù)雜的生理病理變化，為研究疾病的發(fā)病機(jī)制提供更可靠的模型。

- 高通量藥物篩選平臺(tái)的構(gòu)建：Quasi Vivo系統(tǒng)具有良好的擴(kuò)展性和可重復(fù)性，通過將多個(gè)類器官培養(yǎng)模塊連接在一起，可以構(gòu)建高通量藥物篩選平臺(tái)。在這種平臺(tái)上，可以同時(shí)測(cè)試多種藥物對(duì)子宮內(nèi)膜類器官的影響，快速篩選出具有潛在治療效果的藥物，為開發(fā)新的治療策略提供有力支持。

公司主營(yíng)產(chǎn)品：

Kilby 3D-clinostat 旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)儀，

Kilby Gravite微/超重力三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，

3D回轉(zhuǎn)重力環(huán)境模擬系統(tǒng)，隨機(jī)定位儀，

類器官芯片搖擺灌注儀，

Kirkstall 類器官串聯(lián)芯片灌流仿生構(gòu)建系統(tǒng)