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GV3101 感受態(tài)細(xì)胞介紹：

C58(rifR)TipMP90(pTiC58DT-DNA)(gentR)Nopaline

GV3101 感受態(tài)細(xì)胞產(chǎn)品說(shuō)明：

GV3101菌株為C58型背景，核基因中含有篩選標(biāo)簽——利福平抗性基因rif，為了便于轉(zhuǎn)化操作，此菌株攜帶一無(wú)自身轉(zhuǎn)運(yùn)功能的胭脂堿型Ti質(zhì)粒pMP90(pTiC58DT-DNA)，此質(zhì)粒含有vir基因(vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pMP90(pTiC58DT-DNA)質(zhì)粒自身的T-DNA轉(zhuǎn)移功能被破壞，但可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載體T-DNA順利轉(zhuǎn)移)。pMP90(pTiC58DT-DNA)型Ti質(zhì)粒含有篩選標(biāo)簽：gent，賦予GV3101菌株慶大霉素抗性，適用于擬南芥、煙草、玉米、土豆等植物的轉(zhuǎn)基因操作，本公司生產(chǎn)的GV3101化學(xué)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，pCAMBIA2301質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率>104cfu/μgDNA。

操作方法：

1.取-80℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)于室溫或手心片刻待其部分融化，處于冰水混合狀態(tài)時(shí)插入冰中。

2.每100μl感受態(tài)加入0.01-1μg質(zhì)粒DNA（轉(zhuǎn)化效率較高，次使用前做預(yù)實(shí)驗(yàn)確定所加質(zhì)粒的量），用手管底混勻，依次于冰上靜置5分鐘、液氮5分鐘、37℃水浴5分鐘、冰浴5分鐘。

3.加入700μl無(wú)抗生素的LB或YEB液體培養(yǎng)基，于28℃振蕩培養(yǎng)2~3小時(shí)。

4.6000rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應(yīng)抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天。

（當(dāng)平板只含有50μg/mlkan時(shí)，28℃培養(yǎng)48h即可；平板中同時(shí)加入50μg/mlkan，20μg/mlrif時(shí)，需28℃培養(yǎng)60h；如果使用的平板含有50μg/mlrif則需要28℃培養(yǎng)72-90h）。

注意事項(xiàng)：

1.加入質(zhì)粒時(shí)體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10；質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機(jī)物污染，轉(zhuǎn)化效率急劇下降；質(zhì)粒增大一倍，轉(zhuǎn)化效率下降一個(gè)數(shù)量級(jí)。

2.混入質(zhì)粒時(shí)應(yīng)輕柔操作。轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少終用于涂板的菌量。

3.平板上陽(yáng)性克隆密度過(guò)大時(shí)，由于營(yíng)養(yǎng)不足，陽(yáng)性克隆生長(zhǎng)變慢，菌落變小，為了獲得大的菌落，應(yīng)減少質(zhì)粒用量。

4.利福平濃度不應(yīng)高于25μg/ml，過(guò)高的利福平濃度不利于農(nóng)桿菌生長(zhǎng)，會(huì)降低其生長(zhǎng)速度和轉(zhuǎn)化效率。本公司感受態(tài)計(jì)算轉(zhuǎn)化效率時(shí)所用平板只含有50μg/mlkan，若所用平板含有20μg/mlrif則轉(zhuǎn)化效率降低到1/2。

5.培養(yǎng)基中加入利福平的目的是防止雜菌生長(zhǎng)、篩選農(nóng)桿菌；根據(jù)所用菌株抗性加入Ti質(zhì)粒篩選抗生素可防止Ti質(zhì)粒丟失，但Ti質(zhì)粒篩選抗生素不利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)基因操作，所以一般培養(yǎng)農(nóng)桿菌時(shí)不考慮這些抗生素，Ti質(zhì)粒丟失的概率極低(可以忽略)。

備注：

1、農(nóng)桿菌相關(guān)抗生素配方：

抗生素	配方	原液	工作液
羧芐青霉素（carb）	雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌	50 mg/ml	50 μg/ml
硫酸卡那霉素（kan）	雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌	50 mg/ml	50 μg/ml
鏈霉素（strep）	雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌	10 mg/ml	50 μg/ml
利福平（rif）	DMSO溶解，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌	10 mg/ml	20 μg/ml
慶大霉素（gent）	雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌	20 mg/ml	40 μg/ml

2、常用農(nóng)桿菌抗性：（R：抗；S：敏感。）

農(nóng)桿菌菌株	羧芐青霉素(carb)	鏈霉素(strep)	利福平(rif)	慶大霉素(gent)	硫酸卡那霉素(kan)
AGL-1	R	S	R	S	S
EHA101	S	S	R	S	R
EHA105	S	S	R	S	S
LBA4404	S	R	R	S	S
GV3101	S	S	R	R	S

3、LB及YEB配方：

component	LB(液體)/L	LB(固體)/L	component	YEB(液體)/L	YEB(固體)/L
Tryptone	10 g	10 g	Tryptone	5 g	5 g
Yeast extract	5 g	5 g	Yeast extract	1 g	1 g
NaCl	10 g	10 g	牛肉浸膏	5 g	5 g
NaOH	調(diào)PH到7.0	調(diào)PH到7.0	蔗糖	5 g	5 g
Agar	－	15 g	MgSO4*7H2O	0.49 g	0.49 g
			NaOH	調(diào)PH到7.0	調(diào)PH到7.0
			Agar	－	15 g

10種農(nóng)桿菌化學(xué)轉(zhuǎn)化感受態(tài)產(chǎn)品僅需冰、液氮和37℃ 熱激操作即可，實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單方便，經(jīng)pCAMBIA2301 (11.6 Kb)質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率可達(dá)1×104 cfu/μg。同時(shí)提供7種農(nóng)桿菌電擊感受態(tài)產(chǎn)品，可成功轉(zhuǎn)化大于50 Kb的載體，經(jīng)pCAMBIA2301 (11.6 Kb)質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率可達(dá)1×105 cfu/μg。

感受態(tài)種類(lèi)	轉(zhuǎn)化方法	應(yīng)用
GV3101	化轉(zhuǎn) 電轉(zhuǎn)	適用于擬南芥、煙草、玉米、土豆等植物轉(zhuǎn)基因操作
EHA105	化轉(zhuǎn) 電轉(zhuǎn)	適用于水稻、煙草等植物的轉(zhuǎn)基因操作
AGL1	化轉(zhuǎn) 電轉(zhuǎn)	適用于水稻、擬南芥、楊樹(shù)等植物的轉(zhuǎn)基因操作
LBA4404	化轉(zhuǎn) 電轉(zhuǎn)	適用于菸草、番茄、煙草等植物的轉(zhuǎn)基因操作
EHA101	化轉(zhuǎn) 電轉(zhuǎn)	適用于玉米、水稻、煙草等植物的轉(zhuǎn)基因操作
GV3101(pSoup)	化轉(zhuǎn) 電轉(zhuǎn)	在GV3101菌株中轉(zhuǎn)入help質(zhì)粒：pSoup，可幫助pGreen，62SK，pGs2系列質(zhì)粒在農(nóng)桿菌中復(fù)制
GV3101(pSoup-p19)	化轉(zhuǎn) 電轉(zhuǎn)	在GV3101菌株中轉(zhuǎn)入help質(zhì)粒：pSoup-p19，可幫助pGreen，62SK，pGs2系列質(zhì)粒在農(nóng)桿菌中復(fù)制
GV3101(pJIC SA_Rep)	化轉(zhuǎn) 電轉(zhuǎn)	含輔助質(zhì)粒：pJIC SA_Rep，可幫助pgR106，pgR107，pGreen，pGs2系列質(zhì)粒在農(nóng)桿菌中復(fù)制
EHA105(pSoup)	化轉(zhuǎn)	在EHA105菌株中轉(zhuǎn)入help質(zhì)粒：pSoup，可幫助pGreen，62SK，pGs2系列質(zhì)粒在農(nóng)桿菌中復(fù)制
AGL1(pSoup)	化轉(zhuǎn)	在AGL1菌株中轉(zhuǎn)入help質(zhì)粒：pSoup，可幫助pGreen，62SK，pGs2系列質(zhì)粒在農(nóng)桿菌中復(fù)制