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完整的PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)過(guò)程及實(shí)驗(yàn)器材

閱讀:3495        發(fā)布時(shí)間:2020-10-22

 PCR實(shí)驗(yàn)室儀器:

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?br />通過(guò)本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí) PCR 反應(yīng)的基本原理,掌握 PCR 的基本操作技術(shù)。
【實(shí)驗(yàn)原理】
PCR 用于擴(kuò)增位于兩端已知序列之間的 DNA區(qū)段,即通過(guò)引物延伸而進(jìn)行的重復(fù)雙向
DNA合成。
基本原理及過(guò)程如下:
PCR 循環(huán)過(guò)程中有三種不同的事件發(fā)生:(1)模板變性;(2)引物退火;(3)熱穩(wěn)定 DNA
聚合酶進(jìn)行 DNA合成。
1. 變性:加熱使模板 DNA在高溫下(94-95℃)變性,雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單
鏈,即變性階段。
2. 退火:在體系溫度降至 37-65℃,模板 DNA與引物按堿基配對(duì)原則互補(bǔ)結(jié)合,使引物
與模板鏈 3’端結(jié)合,形成部分雙鏈 DNA,即退火階段。
3. 延伸:體系反應(yīng)溫度升至中溫 72℃,耐熱 DNA 聚合酶以單鏈 DNA 為模板,在引物
的引導(dǎo)下,利用反應(yīng)混合物中的 4 種脫氧核苷三磷酸(dNTP),按 5’到 3’方向復(fù)制出互補(bǔ) DNA,即引物的延伸階段。
上述 3 步為一個(gè)循環(huán),即高溫變性、低溫退火、中溫延伸 3 個(gè)階段。從理論上講,每經(jīng)過(guò)
一個(gè)循環(huán),樣本中的DNA量應(yīng)該增加一倍,新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板,經(jīng)過(guò) 25~30 個(gè)循環(huán)后DNA可擴(kuò)增 106~109倍。
典型的PCR反應(yīng)體系由如下組分組成:DNA模板、反應(yīng)緩沖液、dNTP、MgCl2、兩條合成
的DNA引物、耐熱DNA Taq聚合酶。
【儀器、材料、試劑】
(一) 儀器材料
1.PCR 熱循環(huán)儀
2.電泳凝膠成像系統(tǒng)
3.高速離心機(jī)
4.Tip 頭、離心管
(二) 試劑
1.DNA模板(自己提取 DNA)
2.4種 dNTP
3. 引物 1、引物 2
4. Taq 酶
5. 瓊脂糖
6. DNA相對(duì)分子量標(biāo)準(zhǔn)物
7. 三蒸水
【實(shí)驗(yàn)步驟】
(一)PCR反應(yīng)混合液的配制:反應(yīng)體系 25 μL, 在無(wú)菌的0.2 mL 離心管中按下列操作程序加樣:
1.按下列次序加入下列各組成分:【這一步用的儀器及材料有移液器(含吸頭)、EP管】
反應(yīng)物 體積/μL
ddH2O 17.3
10 x Buffer 2.5                 
25 mmol/L MgCl2 2.0 
10 mmol/L dNTP 0.5 
10 μM 上游引物 1 0.4 μmol/L
10 μM 下游引物 1 0.4 μmol/L
DNA Taq 聚合酶 0.2   2. 用手指輕彈管底,使溶液混勻
3. 高速離心機(jī)瞬時(shí)離心,使溶液集中于管底【離心機(jī)】
(二) PCR 循環(huán)程序【PCR儀】
按下述程序進(jìn)行擴(kuò)增:
 94℃ 預(yù)變性 3min
 94℃ 變性 30s
 50℃ 退火 40s   40cycle
 72℃ 延伸 1min
72℃ 充分延伸 5min
(三)PCR擴(kuò)增結(jié)果的檢測(cè)
1.配制 1.0% 瓊脂糖凝膠 【高壓蒸汽滅菌器、電子天平、制膠板、插樣梳、錐形瓶、微波爐或電爐】                                                   
2.4μl PCR產(chǎn)物上樣 【移液器】                           
3.5-8V/cm的電壓電泳【電泳槽、電泳儀】
4.電泳結(jié)束后,EB 染色20min 【移液器】
5.凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照分析結(jié)果【凝膠成像系統(tǒng)】
【注意事項(xiàng)】
1. 隔離操作區(qū),分裝試劑,簡(jiǎn)化操作程序,使用一次性吸頭。
2. 加樣完成后要瞬時(shí)離心,保證樣品沉于管底。
3. 加樣順序合理化,避免交叉污染。
 

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