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當(dāng)前位置：上海易匯生物科技有限公司>>技術(shù)文章>>DP117 - Li - cor Revert™總蛋白染色試劑用戶指南
高靈敏度：能夠檢測(cè)到低至納克級(jí)別的蛋白質(zhì)，可清晰分辨出不同含量的蛋白質(zhì)條帶，對(duì)于微量蛋白樣品的分析尤為適用，為蛋白質(zhì)組學(xué)研究中對(duì)低豐度蛋白的檢測(cè)提供了有力工具。
寬動(dòng)態(tài)范圍：可同時(shí)準(zhǔn)確檢測(cè)出樣品中含量差異較大的多種蛋白質(zhì)，從高豐度蛋白到低豐度蛋白均能呈現(xiàn)出良好的線性響應(yīng)，適用于復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物的分析，無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行繁瑣的分級(jí)或預(yù)富集處理。
快速染色：相比一些傳統(tǒng)的總蛋白染色方法，如考馬斯亮藍(lán)染色需要數(shù)小時(shí)甚至過(guò)夜，DP117 - Li - cor Revert™試劑能夠在較短時(shí)間內(nèi)完成染色過(guò)程，通常在 [X] 分鐘內(nèi)即可觀察到清晰的蛋白條帶，大大提高了實(shí)驗(yàn)效率。
穩(wěn)定性好：染色后的凝膠在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)熒光信號(hào)穩(wěn)定，不易發(fā)生褪色現(xiàn)象。這使得科研人員有充足的時(shí)間對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行觀察、拍照記錄以及后續(xù)的數(shù)據(jù)分析，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性。
兼容性強(qiáng)：該試劑與常見(jiàn)的聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)（如 SDS - PAGE）兼容，無(wú)論是不同濃度的分離膠還是濃縮膠，都能取得理想的染色效果。同時(shí)，它也適用于多種蛋白質(zhì)樣品制備方法，包括不同來(lái)源的細(xì)胞裂解液、組織勻漿等。
操作簡(jiǎn)便：整個(gè)染色流程簡(jiǎn)單直接，無(wú)需復(fù)雜的儀器設(shè)備和專業(yè)的化學(xué)操作技能。只需按照標(biāo)準(zhǔn)的操作步驟進(jìn)行染色、洗滌等處理，即可獲得高質(zhì)量的染色結(jié)果，降低了實(shí)驗(yàn)操作的難度和出錯(cuò)概率。
凝膠準(zhǔn)備：完成蛋白質(zhì)樣品的聚丙烯酰胺凝膠電泳后，小心取出凝膠，放入合適的染色容器中。建議使用塑料或玻璃制的染色盒，避免使用金屬容器，以防金屬離子對(duì)染色反應(yīng)產(chǎn)生干擾。用去離子水或適當(dāng)?shù)木彌_液輕輕漂洗凝膠 1 - 2 次，每次漂洗時(shí)間約為 [X] 分鐘，以去除凝膠表面殘留的電泳緩沖液和雜質(zhì)，但注意不要過(guò)度漂洗導(dǎo)致蛋白質(zhì)條帶損失。
試劑準(zhǔn)備：從冰箱中取出 DP117 - Li - cor Revert™總蛋白染色試劑，使其在室溫下平衡一段時(shí)間（約 [X] 分鐘），以避免因溫度差異導(dǎo)致試劑在使用過(guò)程中出現(xiàn)沉淀或其他不穩(wěn)定現(xiàn)象。在使用前，輕輕搖勻試劑瓶，確保試劑均勻混合。根據(jù)凝膠的大小和數(shù)量，按照每平方厘米凝膠面積使用 [X] mL 染色試劑的比例，準(zhǔn)確量取所需的染色試劑體積，倒入干凈的容器中備用。
其他材料準(zhǔn)備：準(zhǔn)備適量的洗滌緩沖液，一般可使用含 0.1% Tween - 20 的 PBS 緩沖液（pH 7.4）。同時(shí)，準(zhǔn)備好干凈的濾紙、鑷子等實(shí)驗(yàn)工具，用于后續(xù)操作過(guò)程中的凝膠轉(zhuǎn)移和吸干多余液體。
染色反應(yīng)：將準(zhǔn)備好的染色試劑緩慢倒入裝有凝膠的染色容器中，確保凝膠浸沒(méi)在染色試劑中，且染色試劑均勻覆蓋凝膠表面。為了保證染色均勻性，可將染色容器置于水平搖床上，設(shè)置低速（約 [X] rpm）振蕩，在室溫下進(jìn)行染色反應(yīng)。染色時(shí)間根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求和樣品情況而定，一般情況下，染色 [X] 分鐘即可觀察到初步的蛋白條帶，但對(duì)于一些復(fù)雜樣品或需要更高靈敏度的實(shí)驗(yàn)，可適當(dāng)延長(zhǎng)染色時(shí)間至 [X] 分鐘。在染色過(guò)程中，可觀察到凝膠上的蛋白質(zhì)條帶逐漸顯現(xiàn)出熒光信號(hào)。
洗滌步驟：染色反應(yīng)結(jié)束后，小心倒去染色試劑。染色試劑可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的環(huán)保規(guī)定進(jìn)行妥善處理，切勿隨意丟棄。然后，向染色容器中加入適量的洗滌緩沖液，將凝膠浸泡在洗滌緩沖液中，在水平搖床上以中速（約 [X] rpm）振蕩洗滌 [X] 次，每次洗滌時(shí)間為 [X] 分鐘。洗滌的目的是去除凝膠表面未結(jié)合的染色試劑，降低背景熒光信號(hào)，提高蛋白條帶的清晰度和對(duì)比度。每次洗滌后，使用干凈的濾紙小心吸干凝膠表面多余的洗滌緩沖液，但注意不要刮傷凝膠。
熒光成像：洗滌完成后，將凝膠置于近紅外熒光成像系統(tǒng)中進(jìn)行觀察和拍照。根據(jù)成像系統(tǒng)的操作說(shuō)明，設(shè)置合適的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)，對(duì)于 DP117 - Li - cor Revert™試劑，激發(fā)波長(zhǎng)一般在 [具體激發(fā)波長(zhǎng)范圍]，發(fā)射波長(zhǎng)在 [具體發(fā)射波長(zhǎng)范圍]。調(diào)整成像系統(tǒng)的曝光時(shí)間、增益等參數(shù)，以獲得清晰、對(duì)比度良好的蛋白條帶圖像。確保成像環(huán)境光線較暗，避免環(huán)境光對(duì)熒光信號(hào)產(chǎn)生干擾。
條帶分析：使用專業(yè)的凝膠分析軟件對(duì)拍攝的圖像進(jìn)行分析。軟件可用于測(cè)量蛋白條帶的強(qiáng)度、分子量大?。ㄍㄟ^(guò)與已知分子量的蛋白 Marker 條帶對(duì)比）以及計(jì)算不同條帶的相對(duì)含量等參數(shù)。在分析過(guò)程中，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求設(shè)置合適的閾值和背景扣除參數(shù)，以提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。將分析結(jié)果與實(shí)驗(yàn)預(yù)期進(jìn)行對(duì)比，判斷蛋白質(zhì)樣品的組成和表達(dá)情況，為后續(xù)的科研工作提供數(shù)據(jù)支持。
試劑保存：DP117 - Li - cor Revert™總蛋白染色試劑應(yīng)避光保存于 4℃冰箱中。避免試劑受到光照、高溫或反復(fù)凍融，這些因素可能會(huì)導(dǎo)致試劑的活性降低，影響染色效果。在每次使用后，應(yīng)及時(shí)將試劑瓶蓋緊，放回冰箱保存。
安全防護(hù)：在使用試劑過(guò)程中，需佩戴手套、護(hù)目鏡等防護(hù)裝備，避免試劑與皮膚和眼睛直接接觸。若不慎接觸到試劑，應(yīng)立即用大量清水沖洗，并根據(jù)具體情況及時(shí)就醫(yī)。試劑具有一定的化學(xué)腐蝕性，操作時(shí)應(yīng)在通風(fēng)良好的環(huán)境中進(jìn)行，避免吸入試劑揮發(fā)的氣體。
實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化：不同的實(shí)驗(yàn)樣品和實(shí)驗(yàn)?zāi)康目赡苄枰獙?duì)染色條件進(jìn)行優(yōu)化。例如，對(duì)于某些特殊來(lái)源的蛋白質(zhì)樣品，可能需要調(diào)整染色時(shí)間、染色試劑濃度或洗滌次數(shù)等參數(shù)，以獲得最佳的染色效果。在進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)前，建議進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，摸索出適合自己樣品的最佳實(shí)驗(yàn)條件。
凝膠質(zhì)量：凝膠的制備質(zhì)量對(duì)染色結(jié)果有重要影響。確保在制備聚丙烯酰胺凝膠時(shí)，各試劑的比例準(zhǔn)確、混合均勻，凝膠聚合充分且無(wú)氣泡。電泳過(guò)程中，要保證電壓、電流穩(wěn)定，避免蛋白質(zhì)條帶出現(xiàn)拖尾、變形等異?，F(xiàn)象，以保證染色后的蛋白條帶能夠準(zhǔn)確反映樣品中蛋白質(zhì)的真實(shí)情況。
儀器校準(zhǔn)：在使用近紅外熒光成像系統(tǒng)前，需對(duì)儀器進(jìn)行校準(zhǔn)，確保儀器的波長(zhǎng)準(zhǔn)確性、熒光強(qiáng)度測(cè)量準(zhǔn)確性等指標(biāo)符合要求。定期對(duì)儀器進(jìn)行維護(hù)和清潔，防止儀器內(nèi)部光學(xué)部件受到污染，影響成像質(zhì)量。同時(shí)，要注意儀器的軟件版本是否為最新，及時(shí)更新軟件以獲得更好的分析功能和數(shù)據(jù)處理能力。
染色條帶不清晰或無(wú)條帶：可能原因一是染色時(shí)間過(guò)短，可適當(dāng)延長(zhǎng)染色時(shí)間再次觀察；二是蛋白質(zhì)樣品上樣量過(guò)低，可增加上樣量并重做實(shí)驗(yàn)；三是染色試劑失效，檢查試劑保存條件和有效期，若試劑已過(guò)期或保存不當(dāng)，應(yīng)更換新的試劑。
背景熒光過(guò)高：可能是洗滌不充分，增加洗滌次數(shù)或延長(zhǎng)洗滌時(shí)間；也可能是染色試劑濃度過(guò)高，可適當(dāng)降低染色試劑濃度，重新進(jìn)行染色實(shí)驗(yàn)。另外，確保實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用的容器和工具干凈無(wú)污染，避免引入雜質(zhì)導(dǎo)致背景升高。
條帶出現(xiàn)拖尾或變形：這可能是電泳過(guò)程中電壓不穩(wěn)定、凝膠制備不均勻或樣品存在雜質(zhì)等原因引起的。檢查電泳設(shè)備的電源穩(wěn)定性，優(yōu)化凝膠制備過(guò)程，確保凝膠均勻；對(duì)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行進(jìn)一步純化，去除雜質(zhì)后再進(jìn)行電泳和染色實(shí)驗(yàn)。
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