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翌圣生物科技（上海）股份有限公司
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16812ESHieff® Fast Cell Direct RT set (for sybr)
| 參考價: | 面議 |
具體成交價以合同協(xié)議為準- 16812ES 產(chǎn)品型號
- Yeasen/翌圣生物 品牌
- 生產(chǎn)商 廠商性質(zhì)
- 上海市 所在地
訪問次數(shù)：216更新時間：2025-02-07 13:47:21
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產(chǎn)品簡介
| 供貨周期 | 兩周 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,生物產(chǎn)業(yè) |
|---|
產(chǎn)品介紹
Hieff® Fast Cell Direct SYBR Green RT-qPCR Kit 適用于對各種動物細胞進行RNA提取（如cell line 化的貼壁細胞和懸浮細胞、原代培養(yǎng)細胞、各種干細胞、iPS 細胞等），無需提RNA，可直接進行qPCR表達分析，用時短，操作簡單，出錯率低，最短只需1.5小時就可高效完成從模板制備到反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及基因表達分析等步驟。該產(chǎn)品為染料法細胞直擴RT-qPCR試劑盒的反轉(zhuǎn)錄模塊，為補充試劑。
組分信息
組分編號 | 組分名稱 | 16812ES40 | 16812ES60 |
16812-A | 4× Hifair® FCD RT Mix | 200 μL | 500 μL |
16812-B | RNase Free H2O | 2 mL | 5 mL |
儲存條件
長期保存時請于-25~-15℃保存，有效期6個月。
使用說明
一、裂解產(chǎn)物的制備
將試劑放置室溫下融化，使用前上下顛倒，輕輕混勻，并輕微離心后使用，避免起泡。沒有混勻試劑、使用振蕩器混勻、未在冰上配置試劑等會導(dǎo)致反應(yīng)性能下降。
將細胞轉(zhuǎn)移至離心管中*，5000 rpm離心2 min收集細胞**，充分吸除培養(yǎng)基。若貼壁細胞在96孔板中培養(yǎng)，可直接吸除培養(yǎng)基。
各個孔內(nèi)加入FCD Washing Buffer 150 μL，吸打清洗細胞，5000 rpm離心2 min，吸盡FCD Washing Buffer。
各孔中加入48 μL FCD Lysis Buffer溶液，2 μL DNase I溶液，室溫吸打混勻后靜置5 min，孵育后加入2.5 μL FCD Stop Solution***, 吸打混勻5次左右，即可得到裂解產(chǎn)物****，細胞數(shù)量超過1× 105 cells時可能會有裂解殘留物屬正常現(xiàn)象。
*50 μL裂解體系適配細胞數(shù)的基本要求是每孔1× 104，該試劑盒可使用范圍是1 × 103 - 1 × 106 cells，若細胞數(shù)量較多，可適當?shù)缺壤黾覨CD Lysis Buffer溶液和DNase Ⅰ溶液的用量。
**不同細胞的離心條件不同，請使用適合于所用細胞的離心速度進行離心。
***50 μL的裂解液需加入2.5 μL的FCD Stop Solution。依實驗需要，加入裂解液量增大時需相應(yīng)增大FCD Stop Solution的量。
****細胞裂解產(chǎn)物溶液長期保存時，請置于-25~-15℃。
二、反轉(zhuǎn)錄
室溫融化4× Hifair® FCD RT Mix后輕微顛倒混勻，置于冰上并按下表配置反應(yīng)體系：
組分 | 體積 （μL） | 終濃度 |
4× Hifair® FCD RT Mix | 5 | 1× |
裂解產(chǎn)物* | x | - |
RNase-free H2O | Up to 20 | - |
表1 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系
*避免吸入細胞碎片，推薦使用量為2-5 μl，最大不超過反應(yīng)體系的45%。
移液器輕輕混勻上述配制的反應(yīng)液，按下表程序進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)**：
反應(yīng)溫度 | 反應(yīng)時間 |
55℃ | 15 min |
85℃ | 5 min |
表2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序
**反轉(zhuǎn)錄溫度推薦使用55℃，對于高GC含量模板或者復(fù)雜模板，可將反轉(zhuǎn)錄溫度提高到 60℃。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可直接進行下游RT-qPCR檢測。為避免反轉(zhuǎn)錄體系對qPCR反應(yīng)的抑制，得到合適的Ct值（10-35），可將產(chǎn)物稀釋10-1000倍后使用。若短時間內(nèi)不進行下游實驗，可放置于-25~-15℃保存。
三、熒光定量PCR
體系配置
使用下列組份比例配制反應(yīng)液（配制過程請于冰上進行）：
組分 | 體積（μL） | 終濃度 |
2× Hieff® FCD qPCR SYBR Master Mix | 10 | 1× |
Forward Primer (10 μM) | 0.4 | 200 nM |
Reverse Primer (10 μM) | 0.4 | 200 nM |
反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物* | x | - |
RNase-free H2O | Up to 20 | - |
表3 qPCR反應(yīng)體系
*反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的加入量不要超過RT-qPCR體積的1/10。高濃度模板易導(dǎo)致非特異擴增，適當稀釋5-50倍。模板推薦用量4 μL，盡量不要超過6 μL。反應(yīng)性能較差時，可以在0.2-1.0 μM范圍內(nèi)調(diào)整引物濃度。
熒光定量PCR常規(guī)擴增程序（推薦）
循環(huán)步驟 | 溫度 | 時間 | 循環(huán)數(shù) |
預(yù)變性 | 95℃ | 30 sec | 1 |
變性 | 95℃ |
| 35-40 |
退火/延伸 | 60℃ | 30 sec | |
熔解曲線階段 | 儀器默認設(shè)置 | 1 | |
表4 qPCR反應(yīng)程序（常規(guī)）
熒光定量PCR快速擴增程序
實驗條件允許時，也可使用快速程序進行擴增。
循環(huán)步驟 | 溫度 | 時間 | 循環(huán)數(shù) |
預(yù)變性 | 95℃ | 10 sec | 1 |
變性 | 95℃ |
| 40 |
退火/延伸** | 60℃ | 10 sec | |
熔解曲線階段 | 儀器默認設(shè)置 | 1 | |
表5 qPCR反應(yīng)程序（快速）
**退火/延伸溫度、終延伸時間可根據(jù)實驗要求適當調(diào)整。 快速程序適用于絕大多數(shù)基因，個別復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)基因可嘗試常規(guī)程序。
注意事項
使用前，將凍存的各組分充分融解并輕輕混勻后使用。
實驗時，請盡量使用無污染的耗材，避免污染。
本產(chǎn)品避免反復(fù)凍融，配制時應(yīng)避免強光照射。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
本產(chǎn)品僅作科研用途！
