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13592ES4×Multiplex PCR Master Mix for Pathogen
| 參考價(jià): | 面議 |
具體成交價(jià)以合同協(xié)議為準(zhǔn)- 13592ES 產(chǎn)品型號(hào)
- Yeasen/翌圣生物 品牌
- 生產(chǎn)商 廠商性質(zhì)
- 上海市 所在地
訪問次數(shù)：306更新時(shí)間：2025-02-07 13:45:27
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產(chǎn)品簡(jiǎn)介
| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,生物產(chǎn)業(yè) |
|---|
產(chǎn)品介紹
產(chǎn)品描述
本產(chǎn)品適用于多重PCR實(shí)驗(yàn)。4×Multiplex PCR Master Mix for Pathogen以熱啟動(dòng)多重Taq酶制劑與4×擴(kuò)增緩沖液為組分配置成預(yù)混液。本預(yù)混液可快速便捷地用于多重PCR反應(yīng)，擴(kuò)增子GC含量25-75%范圍內(nèi)可以有效擴(kuò)增。具備高均一性、高特異性和高靈敏度的特點(diǎn)，同時(shí)嚴(yán)控背景菌。本試劑可兼容30~100對(duì)以內(nèi)不同大小片段的多重?cái)U(kuò)增，也可用于進(jìn)行數(shù)千重及以上擴(kuò)增子的捕獲?？蓱?yīng)用病原微生物檢測(cè)、環(huán)境微生物鑒定、食品安全檢測(cè)等多個(gè)應(yīng)用場(chǎng)景。
運(yùn)輸與保存方式
冰袋運(yùn)輸。-25 ~ -15℃儲(chǔ)存，有效期2年。
實(shí)驗(yàn)流程
推薦反應(yīng)體系：
一輪反應(yīng)體系
組分 | 體積（μL） | 終濃度 |
4×Hieff® Multiplex PCR Master Mix for Pathogen | 7.5 | 1× |
Primer mix | x | 0.02 μM-0.5 μM |
模板DNA | x | 1 ng-400 ng |
無菌超純水 | x | - |
總體積 | To30 |
【注】
1上表中DNA量和引物濃度均為推薦用量和濃度，可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)情況進(jìn)行調(diào)整最適濃度。
2）參考建議：每條引物的濃度可在0.02 μM-0.5 μM范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)整。
3）預(yù)混液中已經(jīng)包含擴(kuò)增所需要的酶、dNTP、鹽離子等，無需額外添加。
二輪反應(yīng)體系
組分 | 體積（μL） | 終濃度 |
2×Hieff® Multiplex PCR Master Mix for Pathogen（Cat.13581） | 15 | 1× |
Primer Index mix | 4（~6 pmol） | |
一輪純化產(chǎn)物 | 11 | |
無菌超純水 | x | - |
總體積 | To 30 |
推薦反應(yīng)程序：
循環(huán)步驟 | 溫度（℃） | 時(shí)間 | 循環(huán)數(shù) |
預(yù)變性 | 95℃ | 3 min | 1 |
變性 | 95℃ | 30 sec | X |
退火 | 60℃ | 30 sec | |
延伸 | 72℃ | 30 sec | |
終延伸 | 72℃ | 3 min | |
暫存 | 4℃ | - | 1 |
【注】
退火時(shí)間可以根據(jù)Panel種類不同，進(jìn)行適當(dāng)延長(zhǎng)，或者是梯度退火，比如64℃ 1 min，60℃ 1 min;
延伸時(shí)間以最長(zhǎng)片段為準(zhǔn)。延伸時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增增多，可通過縮短延伸時(shí)間來提高擴(kuò)增特異性，延伸時(shí)間不少于30 sec。
針對(duì)模板含量較低的樣本，可通過增加循環(huán)數(shù)提高擴(kuò)增產(chǎn)出。
Panel引物重?cái)?shù)較多時(shí)可增加退火時(shí)間，調(diào)整梯度退火程序，或者根據(jù)已有Panel的合適的PCR反應(yīng)程序進(jìn)行測(cè)試。
循環(huán)數(shù)推薦：
單管引物重?cái)?shù) | 推薦循環(huán)數(shù) （10 ng gDNA ） | 退火延伸時(shí)間 | |
一輪 | 二輪 | ||
10-50 | 10~28 | 18~28 | 30 s~2 min |
50-200 | 10~28 | 16~28 | 30 s~2 min |
200-800 | 10~28 | 14~28 | 30 s~2 min |
800以上 | 10~28 | 12~28 | 30 s~4 min |
【注】
上表是基于10 ng gDNA進(jìn)行的一輪及二輪循環(huán)數(shù)的推薦；當(dāng)投入量大于10 ng，二輪的相應(yīng)的循環(huán)數(shù)可以減少；當(dāng)投入量小于10 ng，一，二輪的相應(yīng)的循環(huán)數(shù)要相應(yīng)的增加。
多重?cái)U(kuò)增引物純化
一輪 PCR 產(chǎn)物 0.9×磁珠純化
1) 準(zhǔn)備工作：將 Hieff NGS® DNA Selection Beads 磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少 30 min。 配制 80%乙醇。
2) 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。
3) 吸取 27 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads（0.9×，Beads:DNA=0.9:1）至一輪 PCR 產(chǎn)物中，室溫孵育 5 min。
4) 將 PCR 管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約 5 min），小心移除上清。
5) 保持 PCR 管始終置于磁力架中，加入 200 μL 新鮮配制的 80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育 30 sec 后，小心移除上清。
6) 重復(fù)步驟 5，總計(jì)漂洗兩次。
7) 保持 PCR 管始終置于磁力架中，開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（不超過 5min）。
8) 直接加入 11 μL ddH2O，將 PCR 管從磁力架中取出，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置 5 min。進(jìn)入下一步反應(yīng)。
二輪 PCR 產(chǎn)物 0.9×磁珠純化
1) 準(zhǔn)備工作：將 Hieff NGS® DNA Selection Beads 磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少 30 min。 配制 80%乙醇。
2) 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。
3) 吸取 27 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads（0.9×，Beads:DNA=0.9:1）至一輪 PCR 產(chǎn)物中，室溫孵育 5 min。
4) 將 PCR 管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約 5 min），小心移除上清。
5) 保持 PCR 管始終置于磁力架中，加入 200 μL 新鮮配制的 80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育 30 sec 后，小心移除上清。
6) 重復(fù)步驟 5，總計(jì)漂洗兩次。
7) 磁珠晾干后，將PCR管從磁力架上取下，加入30 μL Nuclease-free ddH2O覆蓋磁珠，使用移液器吹打混勻。室溫孵育2 min。如果磁珠干燥開裂，適當(dāng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間。
8）將PCR管短暫離心收集后置于磁力架中，分離磁珠和液體直到溶液澄清(約5 min)。 小心吸取25 μL上清轉(zhuǎn)移至新的EP管中，繼續(xù)進(jìn)行下一步反應(yīng)。
