Western及IP細(xì)胞裂解液(無(wú)抑制劑)

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

多種成分均可以從細(xì)胞中提取總蛋白，如Triton、SDS、NP-40等，Western及IP細(xì)胞裂解液是采用一種非變性裂解方法來(lái)裂解細(xì)胞，并獲得總蛋白的裂解液。所獲得的蛋白質(zhì)可以用于PAGE電泳，Western，免疫沉淀(Immunol Precipitation,IP)和免疫共沉淀(co-IP)等，主要由Tris-HCl、NaCl、低濃度Triton X-100， 低濃度sodium pyrophosphate等組成，不含蛋白酶、磷酸酶抑制劑，并維持原有的蛋白間相互作用。

用Western及IP細(xì)胞裂解液(無(wú)抑制劑)(Cell lysis buffer for Western and IP without inhibitors)得到的蛋白，可以用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。由于含有較高濃度的Triton X-100等干擾物質(zhì)，不宜用Bradford法測(cè)定由Western及IP細(xì)胞裂解液獲得樣本的蛋白濃度。

NobleRyder Western及IP細(xì)胞裂解液

產(chǎn)品組成：

操作步驟(僅供參考)：

(一)貼壁培養(yǎng)細(xì)胞

取Western及IP細(xì)胞裂解液室溫溶解混勻，根據(jù)需要選擇添加或不添加蛋白酶抑制劑。

去除貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液，用PBS、NS或無(wú)血清培養(yǎng)液清洗1次，低速離心，棄上清，留取沉淀。

按照6孔板每孔加入100～200μl裂解液的比例，加入Western及IP細(xì)胞裂解液。移液器輕輕吹打，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。通常裂解液作用于細(xì)胞1～5s內(nèi)，細(xì)胞就會(huì)被裂解。

10000～12000g，離心3～5min(如果用冷凍離心機(jī)4℃離心效果更佳)，取上清。

進(jìn)行后續(xù)的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

(二)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞

1、 取Western及IP細(xì)胞裂解液室溫溶解混勻，根據(jù)需要選擇添加或不添加蛋白酶抑制劑。

2、 低速離心懸浮細(xì)胞，棄上清，收集沉淀。

3、 用手指輕彈細(xì)胞，使其松散。按照6孔板每孔細(xì)胞加入100～200μl裂解液的比例，加入Western及IP細(xì)胞裂解液。通常6孔板每孔細(xì)胞加入100μl裂解液已經(jīng)足夠，但如果細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到150～200μl，再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞。充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉淀。

4、 10000～12000g，4℃離心3～5min(如無(wú)低溫離心機(jī)，室溫下離心亦可)，取上清。

5、 進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western、免疫沉淀等操作。

(三)組織樣本

1、 取Western及IP細(xì)胞裂解液置于室溫溶解混勻，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇添加或不添加蛋白酶抑制劑。

2、 把組織jian切成細(xì)小的碎片，越小越好。

3、 取在液氮或超低溫冰箱中冷凍30min以上的組織，迅速用液氮研磨，研磨過(guò)程盡量控制在1～2min之內(nèi)，以減少蛋白的降解。

4、 按照每20mg組織加入100～200μl裂解液的比例，加入含有PMSF的裂解液。冰上或4℃裂解30～60min。

5、 步驟3、4亦可以采用如下過(guò)程：按照每20mg組織加入100～200μl裂解液的比例加入Western及IP細(xì)胞裂解液。用玻璃勻漿器或組織研磨器勻漿，直至充分裂解，過(guò)程盡量控制在1～2min之內(nèi)，以減少蛋白的降解。

6、 按照每20mg組織加入100～200μl裂解液的比例，加入Western及IP細(xì)胞裂解液。

7、 10000～12000g，4℃離心10～15min(如無(wú)低溫離心機(jī)，室溫下離心亦可)，取上清。

8、 進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

注意事項(xiàng)：

1.去除貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液時(shí)，如果血清中的蛋白沒有干擾，可以不用清洗。

2.如果裂解不充分可以適當(dāng)增加裂解液的用量，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當(dāng)減少裂解液的用量。

3.如果細(xì)胞量較多，必需分裝成50～100萬(wàn)細(xì)胞/離心管，然后再裂解。大團(tuán)的細(xì)胞較難裂解充分，而少量的細(xì)胞由于裂解液容易和細(xì)胞充分接觸，相對(duì)比較容易裂解充分。

4.如果組織樣品本身非常細(xì)小，可以適當(dāng)剪切后直接加入裂解液裂解，通過(guò)強(qiáng)烈Vortex使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。直接裂解的優(yōu)點(diǎn)是比較方便，不必使用勻漿器，缺點(diǎn)是不如使用勻漿5.器那樣裂解得比較充分。

6.溶解NobleRyder Cell lysis buffer for Western and IP時(shí)，應(yīng)盡量縮短溶解時(shí)間，避免裂解液中的有效成分失效。

7.細(xì)胞裂解的操作步驟，應(yīng)置于冰上或4℃進(jìn)行。

有效期： 12個(gè)月有效。

NobleRyder Western及IP細(xì)胞裂解液