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深圳市科潤(rùn)達(dá)生物工程有限公司
中級(jí)會(huì)員 | 第17年

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人淀粉樣蛋白770(APP770)ELISA試劑盒

時(shí)間:2011/11/22閱讀:1490
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人APP770酶免ELISA試劑盒
(日本IBL*,貨號(hào):27736)
日本IBL中國(guó)*代理商“深圳科潤(rùn)達(dá)生物工程有限公司”竭誠(chéng)為您服務(wù)
 
簡(jiǎn)介
阿爾茨海默?。ˋD)是典型的老年性癡呆,腦組織內(nèi)淀粉樣蛋白β(Aβ)的累積是造成此病的主要原因,與此同時(shí),患有AD的患者其累積的Aβ90%在腦血管壁上發(fā)現(xiàn)。*,是由可分解出兩種蛋白(β-和γ-分泌)的淀粉樣前體蛋白(APP)產(chǎn)生的,累積在腦組織內(nèi)的Aβ分子主要是由神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的APP表達(dá)產(chǎn)生,即APP695.與此相反,另一不同APP即APP770,表達(dá)于腦血管內(nèi)皮細(xì)胞,報(bào)道稱,APP770產(chǎn)生的Aβ也在腦血管壁上累積
此ELISA試劑盒用于EDTA-血漿,腦脊髓液和上清中人APP770的檢測(cè)
實(shí)驗(yàn)原理
此試劑盒是一種夾心法的ELISA試劑盒,使用了兩種高特異性的抗體。TMB作為顯色劑,zui終溶液所顯示的顏色強(qiáng)度與樣品中APP770的量成正比
檢測(cè)范圍
0.10~6.2ng/mL
預(yù)期用途
僅用于研究,不能用于診斷
此試劑盒用于EDTA-血漿腦脊液和細(xì)胞上清中人APP770的定量檢測(cè)
試劑盒組成
1.       微孔板,96T,包被有抗人APP OX2(351)兔子IgG抗體,親和純化
2.       標(biāo)記抗體濃縮,30X,0.4ml,HRP標(biāo)記的抗人APP(R101A4)小鼠IgG 單抗Fab片段
3.       標(biāo)準(zhǔn)品,0.5ml,2支,重組人APP770
4.       EIA緩沖液,30ml,1%的BSA,含0.05%的吐溫20的PBS
5.       標(biāo)記抗體稀釋液,12ml,1%的BSA,含0.05%的吐溫20的PBS
6.       著色劑,TMB,15ml
7.       終止液,1N硫酸,12ml
8.       洗滌緩沖濃縮液,40X,50ml,0.005%吐溫20的磷酸緩沖液
準(zhǔn)備步驟
試驗(yàn)所需材料但試劑盒未提供


 

l         酶標(biāo)儀(450nm)
l         帶刻度的量筒與燒杯
l         孵箱(37℃±1℃)
l         吸水紙
l         稀釋試管
l         微量移液器和取樣吸頭
l         去離子水
l         坐標(biāo)紙(log/log)
l         用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的試管
l         洗滌瓶
試劑準(zhǔn)備
1.       洗滌緩沖液制備:先將洗滌濃縮液平衡至室溫,充分混勻,然后吸取50ml濃縮液與1950ml的去離子水混勻,即得。配制的洗滌液應(yīng)保存于冰箱內(nèi),并于2周內(nèi)用完
2.       標(biāo)記抗體的制備:用標(biāo)記抗體稀釋液將標(biāo)記抗體稀釋30倍,即得。
例:如果只測(cè)一條板,8孔,則需要標(biāo)記抗體800ul(30ul的標(biāo)記抗體+870ul的標(biāo)記抗體稀釋液,混勻,使用時(shí)每孔加100ul)
此步驟在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前完成
剩余的標(biāo)記抗體濃縮應(yīng)裝于密封瓶?jī)?nèi),保存在4℃
3.       標(biāo)準(zhǔn)品的制備:吸取0.5ml的去離子水至標(biāo)準(zhǔn)品瓶?jī)?nèi),充分混勻,得到12.4ng/ml的人APP770標(biāo)準(zhǔn)品
4.       標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋:準(zhǔn)備8個(gè)試管用于標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋,每管加入230ul的EIA緩沖液
每管的濃度如下
1號(hào)管                 6.2ng/ml
2號(hào)管                 3.1ng/ml
3號(hào)管                 1.55ng/ml
4號(hào)管                 0.78ng/ml
5號(hào)管                 0.39ng/ml
6號(hào)管                 0.19ng/ml
7號(hào)管                 0.10ng/ml
8號(hào)管                 0ng/ml(試驗(yàn)樣品空白)
吸取230ul的標(biāo)準(zhǔn)品于1號(hào)管混勻,然后從1號(hào)管吸取230ul加入2號(hào)管,依次連續(xù)稀釋,標(biāo)準(zhǔn)品范圍為6.2~0.10ng/ml
5.       樣品稀釋:樣品用EIA緩沖液稀釋。如果樣品濃度事先沒(méi)有評(píng)估,我們建議,先用幾個(gè)不同稀釋比例的樣品進(jìn)行檢測(cè),來(lái)確定樣品*稀釋比例
實(shí)驗(yàn)步驟
使用前,所有樣品應(yīng)平衡至室溫,大約30min,然后充分混勻,確保試劑質(zhì)量無(wú)變化,標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行
 
試劑
檢測(cè)樣品
標(biāo)準(zhǔn)品
檢測(cè)樣品對(duì)照孔
試劑對(duì)照孔
檢測(cè)樣品100ul
稀釋標(biāo)準(zhǔn)品(1-7管)100ul
EIA緩沖液(第8管) 100ul
EIA緩沖液100ul
蓋板,4℃下溫育過(guò)夜
洗板7次
酶標(biāo)抗體
100ul
100ul
100ul
-
蓋板,37℃下溫育30min
洗板9次
顯色劑
100ul
100ul
100ul
100ul
室溫避光溫育30min
終止液
100ul
100ul
100ul
100ul
加終止液后30min內(nèi)450nm處讀取OD值
1)  確定好空白對(duì)照孔,并在相應(yīng)的微孔中加入100ul EIA緩沖液。
2)  確定好樣品對(duì)照孔,檢測(cè)樣品孔和標(biāo)準(zhǔn)品孔,然后分別將100ul樣品對(duì)照品、檢測(cè)樣品和稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品加入到相應(yīng)的微孔中。
3)  蓋板,4℃下溫育過(guò)夜
4)  用洗滌瓶洗板,在微孔中加入洗滌液浸泡15-30秒,棄去洗滌液。重復(fù)7次,zui后在吸水紙上拍干。如果是用洗板機(jī)洗板時(shí),用洗板機(jī)洗四次后,再用洗滌瓶洗3次。
5)  每孔加100ul酶標(biāo)抗體,除試劑空白對(duì)照孔外
6)  蓋板,37℃下溫育30min
7)  按照步驟4)洗板9次
8)  將所需量的顯色劑加入到試管中,然后在每一微孔中加入100ul顯色劑。為了避免污染,請(qǐng)勿將剩余試劑在倒入原裝試劑瓶中。
9)  室溫避光溫育30min,加入顯色劑后溶液顏色會(huì)變成藍(lán)色
10)在每孔加100ul終止液,此時(shí)溶液顏色會(huì)變成黃色
11)擦去微孔板底部的污點(diǎn)或水滴,終止液加入后30min內(nèi),在酶標(biāo)儀450nm處讀數(shù)
特別注意
1.       試驗(yàn)樣品采集后應(yīng)立即檢測(cè)或是凍存,凍存的樣品避免反復(fù)凍融,檢測(cè)前應(yīng)在低溫下先將其*溶解混勻
2.       試驗(yàn)樣品用EIA緩沖液稀釋
3.       試驗(yàn)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)做雙份檢測(cè)
4.       試驗(yàn)樣品應(yīng)在中性PH范圍,有機(jī)溶劑的污染可能會(huì)影響檢測(cè)
5.       只能用試劑盒提供的洗滌液洗板,否則會(huì)導(dǎo)致試驗(yàn)失敗
6.       吸水紙上拍干微孔板,不能擦拭
7.       TMB底物液應(yīng)貯存于黑暗處,因其對(duì)光敏感,且避免接觸金屬
8.       加入終止液后30min內(nèi)必須酶標(biāo)儀讀數(shù)
結(jié)果計(jì)算
繪制曲線前,所有的數(shù)據(jù)都應(yīng)減去試驗(yàn)樣品空白值,包括標(biāo)準(zhǔn)品和未知的樣品。以標(biāo)準(zhǔn)品的OD值和濃度在對(duì)數(shù)-對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可直接讀取未知樣品的濃度
 
附:采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè),只需檢測(cè)前設(shè)置好酶標(biāo)儀的相關(guān)參數(shù),如坐標(biāo)參數(shù)(線性,半對(duì)數(shù))和計(jì)算方式參數(shù)(三次回歸、四參數(shù)或雙對(duì)數(shù)曲線方程),即可直接得到結(jié)果
 
 
本譯文僅供參考,詳情請(qǐng)以原文為準(zhǔn)。
 
 
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技術(shù)咨詢:,;手機(jī),;,kerunda@szonline.net
歡迎索取詳細(xì)資料,在線:kerunda_tech

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