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專題：瞬時轉(zhuǎn)染分析研究的步驟

來源：上海北諾生物科技有限公司   2013年07月08日 21:36  

1．瞬時轉(zhuǎn)染分析法

目前有很多功能性分析方法用于研究轉(zhuǎn)錄調(diào)控，zui常用的方法是瞬時轉(zhuǎn)染分析法。該方法是通過一定的轉(zhuǎn)染程序?qū)⒑康恼{(diào)控區(qū)的質(zhì)粒導(dǎo)人培養(yǎng)細胞。在典型情況下，調(diào)控區(qū)調(diào)控“報告基因”的轉(zhuǎn)錄。報告基因是在mRNA和蛋白質(zhì)的水平上都易于被正確檢測到的基因 。產(chǎn)生的質(zhì)粒在培養(yǎng)細胞中轉(zhuǎn)錄后，在特定時刻測定從報告基因上合成的mRNA或蛋白質(zhì)，以評價調(diào)控區(qū)的活性。人們將這種分析方法稱為瞬時轉(zhuǎn)染分析，因為此時質(zhì)粒仍然以附加的形式存在，很少整合進宿主基因組。因此，mRNA或蛋白質(zhì)產(chǎn)物必須在短時間內(nèi)（1～3天）進行測定，否則隨著細胞的生長和分裂，質(zhì)粒會被降解或稀釋。雖然瞬時轉(zhuǎn)染分析法具有多種局限性，但該方法仍然常用于對順式作用DNA序列和調(diào)控基因表達的反式因子進行初步分析。

瞬時轉(zhuǎn)染分析法快捷、簡單，易于對結(jié)果定量，因此成為啟動子功能分析的方法。

瞬時轉(zhuǎn)染分析法也有兩個主要局限性：首先在被轉(zhuǎn)染的細胞中，質(zhì)粒的人工構(gòu)象和拷貝數(shù)可能會導(dǎo)致特異性調(diào)控元件失活或具有特異功能；其次，瞬時轉(zhuǎn)染分析法不能用于檢測那些需誘導(dǎo)或分化時間超過48～72小時時間期限的研究。

2．穩(wěn)定轉(zhuǎn)染分析法

對在瞬時轉(zhuǎn)染分析中未表現(xiàn)出預(yù)期活性的調(diào)控區(qū)，或依賴于特異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的調(diào)控區(qū)，可以采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染分析法，即將含有報告基因的目的基因調(diào)控質(zhì)粒穩(wěn)定地整合進基因組。此外，還需將由組成型啟動子控制的抗藥性基因（如顯性選擇標記基因）穩(wěn)定地整合進基因組進行分析?？顾幮曰蚩梢院蛨蟾婊蛟谕粋€質(zhì)粒上，也可以在不同質(zhì)粒上。將含有報告基因和抗藥性基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細胞，培養(yǎng)基中加入能殺死不穩(wěn)定表達抗藥性基因細胞的藥物，部分質(zhì)粒被穩(wěn)定地整合到染色體上。多數(shù)情況下，在細胞中多個質(zhì)粒分子彼此相連形成多聯(lián)體，多聯(lián)體隨機整合到多聯(lián)體基因組中，因此每個被穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞都具有*的整合位點。然后通過測定被穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞中報道基因的活性，來確定目的調(diào)控區(qū)的活性。

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染分析方法的主要優(yōu)點是，進行分析的調(diào)控區(qū)及報道基因通常位于近乎天然的染色質(zhì)構(gòu)象中，具有近乎天然的拷貝數(shù)，這些特點使調(diào)控區(qū)能更地模擬正常功能。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染分析中，因?qū)D(zhuǎn)染的細胞進行了選擇性擴增，所以克服子瞬轉(zhuǎn)細胞吸收DNA少的缺點。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染分析的另一個特點是對隨后的轉(zhuǎn)錄分析沒有時間限制。因此，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染對所需時間相對較長的研究非常有用。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染分析的缺點是因為要進行藥物篩選和細胞擴增，因此操作難度較大，需要的時間較長。

3．體外轉(zhuǎn)錄分析法

體外轉(zhuǎn)錄分析法適用于難以轉(zhuǎn)染的細胞、在轉(zhuǎn)染分析中不能產(chǎn)生具有可檢測活性的啟動子或進行基因調(diào)控更研究。該分析方法的一個顯著特點是不需要確定有效的轉(zhuǎn)染條件，而且可以在體外反應(yīng)體系中加入抗體，加入或去除某些轉(zhuǎn)錄因子，以評價特定轉(zhuǎn)錄因子的功能。

4．轉(zhuǎn)基因分析法

轉(zhuǎn)基因分析法是將報告基因和目的調(diào)控區(qū)穩(wěn)定地隨機整合到動物基因組中，以檢測天然的前后序列中調(diào)控區(qū)的活性。該分析方法能用于確認轉(zhuǎn)染分析中鑒定的特定調(diào)控區(qū)或調(diào)控元件。

5．同源重組分析法

同源重組分析法很少用，僅在培養(yǎng)細胞或動物基因組中對內(nèi)源基因進行操作。

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