枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備實(shí)驗(yàn)

來源：上海北諾生物科技有限公司 2013年03月02日 22:31

標(biāo)簽：枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備

枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備可以：（1）用于建立枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化體系；（2）用于其基因改造；（3）用于提高枯草芽孢桿菌生產(chǎn)性能相關(guān)研究。

實(shí)驗(yàn)方法

化學(xué)法
化學(xué)改進(jìn)法

實(shí)驗(yàn)材料	枯草芽孢桿菌168
試劑、試劑盒	SPI 培養(yǎng)基 EGTA SPII 培養(yǎng)基檸檬酸鈉 EGTA 氫氧化鈉 KH2PO4 K2HPO4 MgCl2 MgSO4 葡萄糖酵母膏（ NH4 ）2SO4
儀器、耗材	培養(yǎng)箱培養(yǎng)皿錐形瓶紫外分光光度計接種環(huán) 離心管
實(shí)驗(yàn)步驟	一、試劑配制 1. SP 鹽 0.2%（ NH₄ ）₂SO₄，1.4% K₂HPO₄，0.6% KH₂PO₄， 0.02% MgSO₄·7H₂O， 0.1% 檸檬酸鈉。 2. CAYE （100×） 2 % Casamino acid，10%酵母膏。 3. SPI 培養(yǎng)基 SP 鹽溶液加入1 %體積濃度為50%葡萄糖溶液，1 %體積100×CAYE 溶液。 4. SPII 培養(yǎng)基 SPI 培養(yǎng)基加入1 %體積50 mmol/L CaCl₂ 溶液，1 %體積250 mmol/L MgCl₂ 溶液。 5. SP-A Salts Solution（500 ml）（1）0.4% （NH₄）₂SO₄ ：2 g （2）2.8% K₂HPO₄·3H₂O ：14 g （3）1.2% KH₂PO₄ ：6 g （4）0.2% Trisodium Citrate Dihydrate ：1g （5）121°C滅菌20 min。 6. SP-B Salts Solution（500 ml）（1）0.04% MgSO₄·7H2O： 0.2 g （2）121°C滅菌20 min。 7. 100×CAYE Solution（100 ml）（1）2% Casamino acid ：2 g （2）10% Yeast Extract：10 g （3）121°C滅菌20 min。 8. SPI Medium（20 mL） SP-A Salts Solution：9.8 mL SP-B Salts Solution：9.8 mL （1%V）Glucose（50%w/v，115°C滅菌20 min）：200 μL （1%V）100×CAYE：200 μL 10. SPII Medium（6 mL） SPI Medium：5.88mL （1%V）50mM CaCl₂ ：60μL （1%V）250mM MgCl₂：60μL 11. 100×EGTA Solution 10mmol/L EGTA 溶液，溶解時需加少量NaOH 至pH8.0。二、實(shí)驗(yàn)步驟 1. 準(zhǔn)備新鮮的168 單克隆平板，取一滿環(huán)枯草芽孢桿菌甘油菌劃LB 平板，37°C 培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。 2. 轉(zhuǎn)化前一天晚間挑單菌落至3 ml LB 培養(yǎng)基中，37°C，250 r/min 培養(yǎng)過夜。 3. 第二天上午取160 μl 培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至8 ml SPI 培養(yǎng)基中，37°C，250 r/min 培養(yǎng)至對數(shù)生長末期（168 約4-5 h）。 4. 取0.2 ml 生長至對數(shù)期末的培養(yǎng)液至2 ml SPII 培養(yǎng)基中，37 °C，100 r/min 培養(yǎng)90 分鐘。 5. 在上述SPII培養(yǎng)基的菌體中加入20 μl 10mmol/L EGTA，再于37°C，100 r/min 培養(yǎng)10 分鐘。 6. 將上述處理后的菌液分裝成0.5 ml 每管，各加入5 μl DNA（DNA 量不能過高，不超過5 μg），再于37 °C，250 r/min 培養(yǎng)90 分鐘，取菌液涂布篩選平板。收起
注意事項(xiàng)	1. 注意儀器用品的干凈和無菌。 2. 8ml SPI 培養(yǎng)基要放于50 ml 離心管中培養(yǎng)，以保證菌體的生長狀態(tài)，不要使用玻璃試管。 3. 注意測定OD值，一定要等菌體生長至對數(shù)期后期。 4. 保證菌體的濃度，可以提高轉(zhuǎn)化率。展開

實(shí)驗(yàn)方法原理	用GM I和GM II溶液處理枯草芽孢桿菌野生型菌株BS501a，用改進(jìn)的方法制備感受態(tài)細(xì)胞。
實(shí)驗(yàn)材料	野生型枯草芽孢桿菌菌株BS501a
試劑、試劑盒	Spizizen salts母液 CaCl2 氨基酸 GM II培養(yǎng)基 GM I培養(yǎng)基MgCl2 酵母粉 K2HPO4·3H2O 水解酪蛋白葡萄糖檸檬酸鈉蒸餾水 KH2PO4 MgSO4
儀器、耗材	微孔濾膜離心機(jī) 錐形瓶離心管滅菌鍋搖床
實(shí)驗(yàn)步驟	一、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備 1. 枯草芽孢桿菌感受態(tài)制備用貯存液（1）10×Spizizen salts母液： 15% K₂HPO₄·3H₂O，6% KH₂PO₄，2% （NH₄ ） ₂SO₄，0.2% MgSO₄，1% 檸檬酸鈉，溶于蒸餾水中，6.6 ×10⁴ Pa高壓滅菌，室溫貯存。（2）10% 酵母粉、1% 水解酪蛋白和25 mmo l /L MgCl₂， 6.6 ×10⁴ Pa高壓滅菌，酵母粉溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，水解酪蛋白和 MgCl₂溶液可室溫貯存；20%葡萄糖、0.25% 所需氨基酸和0.1 mo l/L CaCl₂，用0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌，葡萄糖溶液和CaCl₂ 溶液室溫貯存，氨基酸溶液- 20℃ 貯存。 2. 枯草芽孢桿菌感受態(tài)制備用培養(yǎng)基（1）GM I：1mL 10 ×Spizizen salts， 0.1 mL，10% 酵母粉，0.25 mL 20% 葡萄糖，0.2 mL 1% 水解酪蛋白，0.2 mL 0.25%所需氨基酸，補(bǔ)充滅菌蒸餾水至總體積10 mL。（2）GM II：1 mL 10×Spizizen salts，0.05 mL10%酵母粉， 0.25 mL 20% 葡萄糖，0.04 mL 1% 水解酪蛋白，0.2 mL 0.25%所需氨基酸， 0.05 mL 0.1mo l/L CaCl₂， 1 mL 25 mmo l/L MgCl₂，補(bǔ)充滅菌蒸餾水至總體積10mL。二、實(shí)驗(yàn)步驟 1. 挑取一新鮮培養(yǎng)的野生型枯草芽孢桿菌菌株BS501a菌落接種于2.5 mL GMI培養(yǎng)基中，30℃，130-150 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。 2. 將過夜培養(yǎng)物按10%接種量接種于2.5 mL新鮮的GM I中，37℃，200- 230 r/min振蕩培養(yǎng)3.5h。 3. 再將培養(yǎng)物進(jìn)行第二次傳代，接種于5 mL GMII培養(yǎng)基中，野生型菌株BS501a按5% 接種量進(jìn)行第二次傳代，37℃，200-230 r/min振蕩培養(yǎng)90 min。 4. 取1mL培養(yǎng)物，5 000 r/min室溫離心5 min，用1 /10體積上清液重新懸浮細(xì)菌沉淀，即為枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞。展開

實(shí)驗(yàn)心得

（共5個心得）

HR微生物: 枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)

枯草芽孢桿菌培養(yǎng)的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)：假如你所希望生長的細(xì)菌是革蘭氏陰性菌,那么我建議你用低濃度的紅霉素就能夠很好的把平板上面的芽孢桿菌抑制了。假如只是需要細(xì)胞壁碎片的話，那就用溶菌酶就好。

發(fā)表于2012-10-16 19:53
gdmc415: 如何判斷是否超聲*

如何判斷枯草芽孢桿菌是否超聲*，根據(jù)網(wǎng)友的經(jīng)驗(yàn)，一般有以下幾個方面： 1. 外觀判斷； 2. 液體的粘滯性； 3. 高速離心； 4. 染色。

發(fā)表于2009-10-10 21:14
Asonlopin: 如何去除基因工程菌?

基因工程菌在培養(yǎng)的過程中會消耗抗生素的，建議加大抗生素的用量，或者在發(fā)酵補(bǔ)料的時候適當(dāng)補(bǔ)加一些抗生

相關(guān)產(chǎn)品

免責(zé)聲明

凡本網(wǎng)注明“來源：化工儀器網(wǎng)”的所有作品，均為浙江興旺寶明通網(wǎng)絡(luò)有限公司-化工儀器網(wǎng)合法擁有版權(quán)或有權(quán)使用的作品，未經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)不得轉(zhuǎn)載、摘編或利用其它方式使用上述作品。已經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)使用作品的，應(yīng)在授權(quán)范圍內(nèi)使用，并注明“來源：化工儀器網(wǎng)”。違反上述聲明者，本網(wǎng)將追究其相關(guān)法律責(zé)任。
本網(wǎng)轉(zhuǎn)載并注明自其他來源（非化工儀器網(wǎng)）的作品，目的在于傳遞更多信息，并不代表本網(wǎng)贊同其觀點(diǎn)和對其真實(shí)性負(fù)責(zé)，不承擔(dān)此類作品侵權(quán)行為的直接責(zé)任及連帶責(zé)任。其他媒體、網(wǎng)站或個人從本網(wǎng)轉(zhuǎn)載時，必須保留本網(wǎng)注明的作品第一來源，并自負(fù)版權(quán)等法律責(zé)任。
如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問題，請?jiān)谧髌钒l(fā)表之日起一周內(nèi)與本網(wǎng)聯(lián)系，否則視為放棄相關(guān)權(quán)利。

精品国产亚洲国产亚洲,久热中文在线观看精品视频,成人三级av黄色按摩,亚洲AV无码乱码国产麻豆

枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)心得

免責(zé)聲明

聯(lián)系我們

關(guān)注我們