酵母感受態(tài)細(xì)胞制備實(shí)驗(yàn)

來(lái)源：上海北諾生物科技有限公司 2013年03月02日 22:29

標(biāo)簽：酵母感受態(tài)細(xì)胞制備

酵母感受態(tài)細(xì)胞制備可以：（1）用于建立酵母轉(zhuǎn)化體系；（2）用于酵母表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建；（3）用于酵母其他分子生物學(xué)研究。

實(shí)驗(yàn)方法

化學(xué)法
試劑盒制備法

實(shí)驗(yàn)材料	釀酒酵母
試劑、試劑盒	YPDA液體培養(yǎng)基蒸餾水甘油二甲基亞砜
儀器、耗材	培養(yǎng)皿離心機(jī) 離心管冰箱
實(shí)驗(yàn)步驟	一、試劑與耗材 1. 試劑細(xì)菌用-酵母提取物（Fisher）、細(xì)菌用-蛋白胨（Fisher）、葡萄糖（Fisher）、細(xì)菌用-瓊脂粉、去離子水、甘油（Sigma）、二甲基亞砜（Sigma）、聚乙二醇3350（Sigma）、醋酸鋰（Sigma）、鮭魚(yú)精子細(xì)胞DNA（Invitrogen）、酵母無(wú)氨基酸氮源（Sigma）、 2-（N-嗎啉代）乙磺酸、腺嘌呤（Sigma）、葡萄糖。 2. 儀器水浴鍋（VWR）、離心機(jī)（Eppendorf）、30 °C搖床與恒溫培養(yǎng)箱（VWR）、培養(yǎng)皿。二、試劑配方 1. YPDA液體或固體培養(yǎng)基（1）1%酵母提取物： 10 g/L （2）2%胰蛋白胨： 20 g/L （3）2%葡萄糖：20 g/L 2. 轉(zhuǎn)化液（1）聚乙二醇3350（50 % （w/v）：260 μl （2）1 M醋酸鋰：36 μl （3）SsDNA（10 mg/ml）：10 μl （4）質(zhì)粒：3 μl （5）總計(jì)：360 μl 3. YNB+ MA 培養(yǎng)基（100 ml）（1）YNB：0.67 g （2）2-（N-嗎啉代）乙磺酸（20mM ）：0.39 g （3）腺嘌呤：0.01 g （4）瓊脂粉：2g （5）葡萄糖：2g 三、制備步驟 1. 在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的兩天前，于YPDA培養(yǎng)基的平皿上活化酵母菌株。 2. 轉(zhuǎn)化前一天，挑取活化的酵母細(xì)胞（單克?。┯赮PDA液體培養(yǎng)基中，30°C，200 rpm培養(yǎng)過(guò)夜。 3. 將培養(yǎng)過(guò)夜的酵母細(xì)胞液按1：3的比例轉(zhuǎn)接與新的YPDA液體培養(yǎng)基中，于30°C搖床內(nèi)，200 rpm培養(yǎng)4 h。 4. 3 000 g 離心 5分鐘收集酵母細(xì)胞，用0.5倍體積的無(wú)菌水洗酵母細(xì)胞。 5. 再次3 000 g 離心 5分鐘。 6. 用0.01倍體積的無(wú)菌水重懸酵母細(xì)胞，并轉(zhuǎn)入適宜的離心管中，20°C ，3 000 g 離心 5分鐘。 7. 用0.01倍體積的無(wú)菌細(xì)胞懸浮液（5 % v/v 甘油，10% v/v 二甲基亞砜）重懸酵母細(xì)胞。 8. 將重懸的酵母細(xì)胞按50 ul分裝到1.5 ml離心管中。 9. 將管放入塑料盒或者紙盒中（逐步梯度冷凍能夠增強(qiáng)酵母的存活率）。 10. 將裝有酵母細(xì)胞的盒子放入-80°C冰箱。（細(xì)胞在-80°C能夠保存一年以上）。收起
其他	一、參考文獻(xiàn) 1. Gietz R.D., Schiestl R.H. （2007）. Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat Protoc 2（1）: 1-4. 2. Lu Y., Chanroj S., Zulkifli L., Johnson M.A., Uozumi N., Cheung A., Sze H. （2011）. Pollen tubes lacking a pair of K+ transporters fail to target ovules in Arabidopsis. Plant Cell 23（1）: 81-93. 展開(kāi)

實(shí)驗(yàn)方法原理	本酵母化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞制備試劑是一種通過(guò)化學(xué)處理，快速制備釀酒酵母化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，用于長(zhǎng)期凍存以備后續(xù)轉(zhuǎn)化的產(chǎn)品。
實(shí)驗(yàn)材料	酵母菌
試劑、試劑盒	YPD培養(yǎng)基酵母化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒
儀器、耗材	離心管冰箱冷凍管保溫冰盒
實(shí)驗(yàn)步驟	一、挑取酵母受體菌的新鮮的單菌落（4℃放置不超過(guò)3周的也可以），接種到裝在50 mL 離心管中的10 mL的自備的YPD培養(yǎng)基中。二、30℃搖晃培養(yǎng)，搖床速度250 rpm/分鐘，直到OD₆₀₀達(dá)到0.6-1.0（相當(dāng)于0.6-1×10⁷細(xì)胞/mL）。三、室溫3 000 rpm離心5 min，棄上清得酵母細(xì)胞沉淀。四、新鮮制備適量的酵母感受態(tài)制備工作液。對(duì)10 mL酵母需要5.25 mL的工作液，其配制方法是：將4.75 mL制備液A、0.25 mL制備液B和0.25 mL制備液C加入到一個(gè)無(wú)菌的離心管中后充分震蕩混勻即可。酵母感受態(tài)制備工作液可放室溫待用。五、用0.5倍體積的新鮮配制的酵母感受態(tài)制備工作液洗滌酵母細(xì)胞沉淀一次（對(duì)10 mL酵母則需要5 mL酵母感受態(tài)制備工作液）。即混合后振蕩1分鐘，室溫3 000 rpm離心3分鐘，去上清得洗滌后的酵母細(xì)胞沉淀。六、再用0.02倍體積的酵母感受態(tài)制備工作液充分重懸菌體（對(duì)10 mL酵母，則需要0.2 mL酵母感受態(tài)制備工作液）。七、按每管0.2 mL分裝到冷凍管中，放入保溫冰盒中冷卻半小時(shí)后再放入-80℃冰箱待用。0.2 mL的感受態(tài)細(xì)胞足夠1次轉(zhuǎn)化使用。展開(kāi)
注意事項(xiàng)	1. 放入保溫冰盒的目的是使溫度緩慢下降，急凍將使轉(zhuǎn)化效率降低，這點(diǎn)跟大腸桿菌感受態(tài)制備過(guò)程不同。展開(kāi)

實(shí)驗(yàn)心得

（共4個(gè)心得）

tigerwjl: 關(guān)于酵母浸膏和酵母粉的問(wèn)題

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