農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備實(shí)驗(yàn)

來源：上海北諾生物科技有限公司 2013年03月02日 22:25

氯化鈣法
電轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌感受態(tài)

實(shí)驗(yàn)方法原理	在基因工程操作中，感受態(tài)細(xì)胞的制備和質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化是一項(xiàng)基本技術(shù)。感受態(tài)是細(xì)菌細(xì)胞具有的能夠接受外源DNA的一種特殊生理狀態(tài)。農(nóng)桿菌的感受態(tài)可用CaCl₂處理而誘導(dǎo)產(chǎn)生。將正在生長的農(nóng)桿菌細(xì)胞加入到低滲的CaCl₂溶液中，0℃下處理便會(huì)使細(xì)菌細(xì)胞膜的透性發(fā)生改變，此時(shí)的細(xì)胞呈現(xiàn)出感受態(tài)。制備好的農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞迅速冷凍于-70℃可保存相當(dāng)一段時(shí)間而不會(huì)對其轉(zhuǎn)化效率有太大的影響。
實(shí)驗(yàn)材料	土壤農(nóng)桿菌LBA4404菌株
試劑、試劑盒	YEB液體培養(yǎng)基酵母提取物牛肉膏蛋白胨蔗糖硫酸鎂氯化鈣利福平儲(chǔ)液
儀器、耗材	超凈工作臺(tái) 恒溫?fù)u床冷凍高速離心機(jī) 高壓滅菌鍋冰箱超低溫冰柜分光光度計(jì) 接種針試管離心管離心管冰浴微量進(jìn)樣器吸頭
實(shí)驗(yàn)步驟	一、實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑 1. 儀器超凈工作臺(tái)，恒溫?fù)u床，冷凍高速離心機(jī)，高壓滅菌鍋，冰箱，-70℃超低溫冰柜，分光光度計(jì)，接種針，10ml試管，50ml離心管，1.5ml離心管，冰浴，微量進(jìn)樣器及吸頭。以上玻璃儀器和離心管需在用前滅菌，滅菌條件：120℃，15分鐘。 2. 材料土壤農(nóng)桿菌LBA4404菌株或其它農(nóng)桿菌菌株 3. 試劑（1）YEB液體培養(yǎng)基（1 L）：酵母提取物1 g，牛肉膏5 g，蛋白胨5 g，蔗糖5 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，pH7.0，高壓滅菌。（2）利福平（Rif）儲(chǔ)液：50 mg/ml （3）20 mM CaCl₂，高壓滅菌。二、實(shí)驗(yàn)步驟 1. 挑取根癌農(nóng)桿菌LBA4404單菌落于3 ml的YEB液體培養(yǎng)基（含Rif 50 mg/l）中，28℃振蕩培養(yǎng)過夜。 2. 取過夜培養(yǎng)菌液1 ml接種于50 ml YEB（Rif 50 mg/l）液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.5。 3. 取2 ml菌液，13 000 rpm，離心30 sec，棄上清。 4、加入1000 μl 20 mM CaCl₂，使農(nóng)桿菌細(xì)胞充分懸浮，冰浴30 min。 5、13 000 rpm，離心30 sec，棄上清，置于冰上，加入500 μl預(yù)冷的20 mM CaCl₂，充分懸浮細(xì)胞，冰浴中保存，24 hr內(nèi)使用，或液氮中速凍1 min，置-70℃保存?zhèn)溆谩?/div> 收起

實(shí)驗(yàn)材料	農(nóng)桿菌菌種
試劑、試劑盒	HEPES NaOH 鏈霉素甘油
儀器、耗材	離心管離心機(jī) 制冰機(jī)
實(shí)驗(yàn)步驟	一、試劑配制 1 mM HEPES的配制：稱取0.119 g HEPES（MW 238.3）粉末，加水溶解，定容至500 ml，用NaOH調(diào)pH至7.0，滅菌后待用。二、實(shí)驗(yàn)步驟 1. 挑取單克隆接種于2 ml YEP（含50 mg/l鏈霉素）液體培養(yǎng)基，28℃，250 rpm，振蕩培養(yǎng)過夜。（如用5 mlYEP，需培養(yǎng)36 h） 2. 將菌液按1:100轉(zhuǎn)移至200 ml YEP（含50 mg/l鏈霉素）培養(yǎng)液中，28℃，250 rpm，振蕩培養(yǎng)至OD=0.3（約4~5 h）。 3. 轉(zhuǎn)入50 ml的無菌離心管，4℃，4 000 rpm離心10 min，棄上清。 4. 用20 ml冰浴的HEPES（1 mM，PH7.0）重懸。 5. 4℃，4 000 rpm離心10 min，棄上清。 6. 重復(fù)4、5步驟2~3次。 7. 用2 ml冰浴的10%甘油重懸。 8. 每管100 μl分裝于1.5 ml無菌的Eppendorf管中，-70℃保存。展開
注意事項(xiàng)	1. HEPES需現(xiàn)用現(xiàn)配。展開

實(shí)驗(yàn)心得

（共4個(gè)心得）

wgr7542: 農(nóng)桿菌的侵染機(jī)理

農(nóng)桿菌質(zhì)粒載體系統(tǒng)，質(zhì)粒載體系統(tǒng)中zui常用的質(zhì)粒有：Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒。

發(fā)表于2005-10-10 10:36
snokey: 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化注意事項(xiàng)

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化注意事項(xiàng)： 1. 感受態(tài)盡量新，而且不要太濃（0.3-0.5）； 2. CaCl2盡量新； 3. 涂板只加Kan 50mg/L，等出了菌落再加到100mg/L； 4. pBI121本身拷貝數(shù)低，轉(zhuǎn)化子可能長的就慢些； 5. LB營養(yǎng)沒有YEP豐富，其實(shí)關(guān)系不大； 6. 4404不好用，能用105就不要用4404，105轉(zhuǎn)化效率通常比4404好的多。

發(fā)表于2006-08-01 23:17
seesky: 農(nóng)桿菌質(zhì)粒提取和酶切問題

從農(nóng)桿菌中可以抽出質(zhì)粒，但做不了酶切試驗(yàn)，原因是： 1. 量太少，主要是菌裂解困難，以及農(nóng)桿菌雙元載體攜帶的是低拷貝復(fù)制子； 2. 雜質(zhì)太多，酶切后呈現(xiàn)smear帶，無法判斷是否有目標(biāo)基因。

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