盡管蛋白質(zhì)組學(xué)已為我們提供了細(xì)胞中蛋白表達(dá)的全景圖譜，但僅有蛋白表達(dá)量信息，遠(yuǎn)不足以解釋生命系統(tǒng)的動態(tài)調(diào)控行為。蛋白質(zhì)的功能狀態(tài)，并不簡單由其表達(dá)水平所決定，而是高度依賴于翻譯后所發(fā)生的共價(jià)修飾事件，即所謂的翻譯后修飾（Post-Translational Modifications, PTMs）。這些修飾包括酶促或非酶促地將化學(xué)基團(tuán)（如磷酸、乙酰、甲基、泛素等）添加至特定氨基酸殘基，從而調(diào)控蛋白質(zhì)的構(gòu)象、酶活性、穩(wěn)定性、亞細(xì)胞定位及其與其他生物大分子的相互作用。

當(dāng)前已有研究表明，超過80%的功能性蛋白質(zhì)在體內(nèi)處于某種翻譯后修飾狀態(tài)，其中許多修飾具備動態(tài)性、可逆性和時(shí)空特異性，可在數(shù)秒至分鐘的尺度內(nèi)響應(yīng)外界刺激。例如，細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中激酶和磷酸酶的協(xié)同作用，可實(shí)現(xiàn)對信號級聯(lián)的放大與反饋調(diào)控；而泛素-蛋白酶體系統(tǒng)通過多聚泛素鏈型的差異，構(gòu)建出復(fù)雜的降解選擇性和非降解性信號傳導(dǎo)通路。更重要的是，多個(gè)修飾往往并非獨(dú)立發(fā)生，而是呈現(xiàn)“串?dāng)_（crosstalk）”關(guān)系，通過互作、競爭、協(xié)同等模式在蛋白質(zhì)表面構(gòu)建出高度復(fù)雜的“修飾碼（PTM code）”，對細(xì)胞命運(yùn)決策與功能分化具有深遠(yuǎn)影響。

Cell Res 24, 143–160 (2014)

真核細(xì)胞中多種可逆和不可逆的蛋白質(zhì)翻譯后修飾 (PTM) 機(jī)制

在系統(tǒng)生物學(xué)視角下，PTMs被認(rèn)為是連接基因型與表型之間的關(guān)鍵橋梁，代表了除表達(dá)量之外的第四層調(diào)控邏輯。其研究不僅為我們揭示細(xì)胞信號網(wǎng)絡(luò)、表觀遺傳調(diào)控與應(yīng)激應(yīng)答等過程的精細(xì)機(jī)制，也為疾病機(jī)制解析、藥物靶點(diǎn)篩選與臨床標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)提供了關(guān)鍵突破口。近年來，新型修飾（如乳酸化、羥丁?；?、谷胱甘肽化等）的陸續(xù)發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步拓展了我們對代謝-表觀-信號聯(lián)通性的理解，表明PTMs是理解生命系統(tǒng)復(fù)雜性的核心切入點(diǎn)之一。

常見的翻譯后修飾類型

蛋白質(zhì)翻譯后修飾（PTMs）涵蓋數(shù)百種不同的化學(xué)修飾類型，其中一些在進(jìn)化中高度保守，另一些則僅限于特定生理狀態(tài)或特定物種。它們主要發(fā)生在蛋白質(zhì)鏈的側(cè)鏈官能團(tuán)上（尤其是Ser, Thr, Tyr, Lys, Arg, Cys等殘基），通過酶促或非酶促的方式引入小分子基團(tuán)、多肽或糖鏈等修飾單位。以下列舉并解析幾類在研究和臨床中zuì jù代表性的PTM類型及其作用機(jī)制：

1、磷酸化（Phosphorylation）

磷酸化是最為廣泛研究的一種PTM，由蛋白激酶（kinase）催化，將ATP來源的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至蛋白質(zhì)的絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）或酪氨酸（Tyr）殘基上，生成磷酸化肽段。該修飾高度動態(tài)，可被磷酸酶（phosphatase）可逆去除，構(gòu)成一種基于開/關(guān)機(jī)制的調(diào)控系統(tǒng)。

這一修飾主導(dǎo)著絕大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)，如MAPK、PI3K-Akt、JAK-STAT等經(jīng)典通路中，磷酸化事件驅(qū)動激酶活化、轉(zhuǎn)錄因子核轉(zhuǎn)位、細(xì)胞周期調(diào)控等關(guān)鍵生物過程。因其反應(yīng)速度快、放大效應(yīng)強(qiáng)，磷酸化常被視為最核心的信息傳遞修飾形式。

PLoS One. 2016 May 31;11(5)

MAPK 級聯(lián)及其激活機(jī)制的示意圖

質(zhì)譜檢測中，磷酸肽因帶負(fù)電荷而需通過IMAC或TiO?進(jìn)行選擇性富集；而位點(diǎn)定位常依賴于高分辨MS/MS數(shù)據(jù)中的中性丟失離子（如–98 Da）以及精確的b/y離子匹配。

2、乙?；?/strong>

乙?；╝cetylation）最早是在組蛋白上發(fā)現(xiàn)，后被證實(shí)廣泛存在于非組蛋白蛋白質(zhì)中。其核心功能在于調(diào)節(jié)賴氨酸殘基正電荷，從而改變蛋白與DNA、蛋白與蛋白之間的靜電相互作用。對組蛋白而言，這種修飾直接關(guān)系到染色質(zhì)的開放程度和轉(zhuǎn)錄可及性，是表觀遺傳調(diào)控的基本符號。

但近年來，非組蛋白乙?；饾u成為研究焦點(diǎn)。在代謝酶、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子和結(jié)構(gòu)蛋白中，乙?；ㄟ^影響構(gòu)象穩(wěn)定性、酶活性甚至亞細(xì)胞定位而參與多層級調(diào)控。例如，p53的多位點(diǎn)乙?；粌H增強(qiáng)其DNA結(jié)合能力，還調(diào)節(jié)其與泛素化系統(tǒng)之間的交叉調(diào)控，延長其半衰期，避免異常降解。

此外，乙酰化與能量代謝的連接尤為緊密。細(xì)胞內(nèi)乙酰輔酶A濃度的波動可直接影響乙酰化水平，形成從代謝通量到表觀狀態(tài)的耦聯(lián)通道。因此，乙?；巡辉僦皇恰稗D(zhuǎn)錄開關(guān)”，而是一種“代謝-表觀信息中介”。

在質(zhì)譜檢測中，乙?；亩斡捎跓o電荷變化，識別難度大，需借助高親和力的anti-acetyl-Lys抗體富集，常采用Lys-N或Trypsin酶解以保留關(guān)鍵修飾位點(diǎn)，定量推薦使用TMT或label-free策略。數(shù)據(jù)分析中需特別注意與其他修飾（如甲?；?、谷酰化）質(zhì)量漂移接近所造成的定性混淆。

3、甲基化（Methylation）

與磷酸化或乙?；煌?，甲基化（methylation）并不引起電荷變化，其功能也更偏向于構(gòu)建“穩(wěn)定狀態(tài)”。組蛋白甲基化是這一類別中研究最深的修飾類型，不同位點(diǎn)和甲基數(shù)目（mono-/di-/tri-methylation）對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與基因表達(dá)有著精確調(diào)控功能。例如，H3K4me3常作為啟動子激活的標(biāo)記，而H3K27me3則與沉默區(qū)域高度相關(guān)。

但甲基化的作用遠(yuǎn)不止于組蛋白。諸如轉(zhuǎn)錄因子、信號蛋白、RNA結(jié)合蛋白等非組蛋白甲基化事件，在細(xì)胞發(fā)育、胚胎分化和干細(xì)胞命運(yùn)決定中逐漸顯露其調(diào)控效應(yīng)。一個(gè)值得關(guān)注的問題是，許多甲基化位點(diǎn)的生物學(xué)功能目前仍屬未知，部分甲基化甚至可能作為“保護(hù)性封閉”標(biāo)志而非功能激活，提示我們對其“功能性解讀”仍處在初級階段。

質(zhì)譜上，甲基化修飾的質(zhì)量變化小（+14.0157 Da），需精確區(qū)分單/雙/三甲基狀態(tài)。且修飾異構(gòu)體之間譜圖重疊嚴(yán)重，通常建議采用高分辨率MS和多重酶切驗(yàn)證，輔以抗甲基化抗體富集提高特異性。

4、泛素化與類泛素修飾

泛素化（ubiquitination）是指將76個(gè)氨基酸組成的小分子蛋白——泛素（ubiquitin）通過異肽鍵（isopeptide bond）共價(jià)連接至目標(biāo)蛋白賴氨酸殘基的過程。泛素化是zuì jù“可塑性”的修飾類型之一。它既可作為蛋白質(zhì)降解的直接標(biāo)記，也能通過構(gòu)建多種鏈型（K48、K63、K11、線性鏈等）參與細(xì)胞信號調(diào)控、DNA修復(fù)、膜轉(zhuǎn)運(yùn)乃至轉(zhuǎn)錄調(diào)控等過程。

Apoptosis. 2022 Oct; 27(9-10):668-684

各種類型的泛素連接及相關(guān)功能

除泛素外，細(xì)胞中還存在一類結(jié)構(gòu)相似、但功能側(cè)重不同的“小泛素樣蛋白”（Ubiquitin-like proteins, Ubls），包括：

● SUMO（小泛素相關(guān)修飾）：參與轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控、DNA修復(fù)和核-胞質(zhì)運(yùn)輸

● NEDD8：通過修飾Cullin蛋白調(diào)節(jié)泛素E3連接酶復(fù)合體（CRL）的活性

● ISG15：在抗病毒應(yīng)答中表達(dá)上調(diào)，影響干擾素信號放大

與大多數(shù)小分子修飾不同，泛素為完整蛋白，其在樣品酶解后留下一個(gè)典型的二肽殘基（Gly-Gly），位于賴氨酸側(cè)鏈上，產(chǎn)生+114.0429 Da的質(zhì)量偏移。識別這類殘基的關(guān)鍵在于：

● 使用K-ε-GG抗體富集特異性肽段

● 結(jié)合高分辨質(zhì)譜（MS/MS）獲得b/y離子精確定位

● 輔以多酶聯(lián)合酶解（如Trypsin + Lys-C）提高修飾覆蓋率

5、糖基化

糖基化（glycosylation）是wéi yī以“結(jié)構(gòu)多樣性”為功能基礎(chǔ)的翻譯后修飾類型。與磷酸化、乙?；@類“功能性單點(diǎn)修飾”不同，糖基化的功能往往依賴于其糖鏈結(jié)構(gòu)、長度、分支與位置的變化。

N-糖基化（Asn）與O-糖基化（Ser/Thr）在細(xì)胞表面蛋白、分泌蛋白和受體蛋白中廣泛存在，調(diào)節(jié)其折疊效率、膜定位、免疫逃逸能力等。例如，PD-L1的N-糖基化增強(qiáng)其穩(wěn)定性和膜表達(dá)，是腫瘤免疫抑制機(jī)制的一部分。糖鏈的改變也是腫瘤轉(zhuǎn)化過程中的重要標(biāo)志，如Tn抗原（O-GalNAc）在多種癌細(xì)胞中表達(dá)升高。

糖基化的最大挑戰(zhàn)在于其異質(zhì)性：同一糖基化位點(diǎn)可能存在數(shù)十種不同的糖型（glycoforms），這對檢測與定量帶來巨大壓力。HILIC、PGC等色譜方法結(jié)合MSn技術(shù)是當(dāng)前主流策略，但對于復(fù)雜糖型解析仍需多平臺數(shù)據(jù)融合。

此外，糖基化研究高度依賴生物信息學(xué)注釋，如GlycoWorkbench、Byonic中集成的糖鏈結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫，在非靶向檢測中更是bù kě huò quē。

6、新型修飾

隨著高分辨率質(zhì)譜（HR-MS）和靶向富集技術(shù)的發(fā)展，許多以往難以捕捉的新型翻譯后修飾逐漸進(jìn)入研究視野。這些修飾通常與代謝物直接相關(guān)，具有時(shí)間尺度快、調(diào)控范圍廣、對環(huán)境變化高度敏感的特征，成為連接細(xì)胞代謝狀態(tài)與表觀遺傳程序之間的關(guān)鍵樞紐。以下是當(dāng)前研究熱點(diǎn)中數(shù)種具代表性的新型修飾：

（1）乳酸化（Lactylation）

乳酸化（Kla）（lactylation）是zuì jù代表性的代謝型修飾，最早由Zhang等于2019年在組蛋白H3上發(fā)現(xiàn)，是由內(nèi)源性L-乳酸供體通過酰基轉(zhuǎn)移機(jī)制修飾賴氨酸側(cè)鏈的過程。該修飾在缺氧、糖酵解增強(qiáng)（Warburg效應(yīng)）、免疫應(yīng)答等背景下顯著上調(diào)，已被證實(shí)能夠調(diào)控巨噬細(xì)胞極化（M1→M2）、干細(xì)胞命運(yùn)和癌基因表達(dá)等過程。

Trends Biochem Sci. 2020 Mar;45(3):179-182.

組蛋白乳酸化介導(dǎo)基因表達(dá)促進(jìn)M2樣表型

其機(jī)制表明乳酸不僅是代謝副產(chǎn)物，更是可直接參與調(diào)節(jié)染色質(zhì)活性的信號分子。研究已發(fā)現(xiàn)組蛋白以外的非組蛋白靶點(diǎn)（如酶類、轉(zhuǎn)錄因子）也可發(fā)生乳酸化，提示其在轉(zhuǎn)錄調(diào)控與蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮廣泛功能。

檢測難點(diǎn)：乳酸化肽段的質(zhì)量偏移（+72.0211 Da）容易與其他修飾混淆，且靶點(diǎn)豐度極低，需結(jié)合特異性抗體富集與納升LC-MS/MS檢測。

（2）羥丁酰化（β-Hydroxybutyrylation, Kbhb）

β-羥丁酸（BHB）是饑餓、禁食或酮飲食條件下生成的主要酮體，它可在體內(nèi)高濃度積累，并作為修飾底物引入賴氨酸側(cè)鏈，形成β-羥丁?；揎?。該修飾在肝臟、肌肉、腦組織中廣泛存在，被認(rèn)為是能量缺乏狀態(tài)下表觀轉(zhuǎn)錄程控的關(guān)鍵標(biāo)志。

研究發(fā)現(xiàn)Kbhb可競爭乙?；稽c(diǎn)，進(jìn)而抑制炎癥基因表達(dá)（如NF-κB靶基因），提升氧化應(yīng)激耐受性，是長壽、代謝健康等領(lǐng)域的重要關(guān)注對象。

技術(shù)挑戰(zhàn)：Kbhb修飾的異構(gòu)體較多，需通過高分辨MS及串聯(lián)質(zhì)譜碎片信息精細(xì)鑒定；結(jié)合SILAC標(biāo)記或PRM/targeted MS有助于修飾定量。

（3）谷胱甘肽化（S-glutathionylation）

谷胱甘肽（GSH）是細(xì)胞內(nèi)最主要的抗氧化小分子，其在氧化脅迫狀態(tài)下可通過二硫鍵與蛋白質(zhì)巰基形成混合二硫鍵（S-SG），即S-谷胱甘肽化。該修飾對保護(hù)重要酶類免受不可逆氧化、調(diào)控酶活性、傳遞ROS信號等具有重要意義。

S-glutathionylation通常發(fā)生在Cys殘基上，具有可逆性，可被谷胱甘肽還原酶（GR）或硫氧還蛋白酶（Trx）系統(tǒng)去修飾。

質(zhì)譜識別要點(diǎn)：修飾質(zhì)量偏移為+305.0682 Da，因巰基反應(yīng)活性高，樣品制備需快速低溫處理，避免假陽性。衍生化捕獲策略（如Biotin-GSH）已逐步被用于富集低豐度修飾肽。

（4）乙酰谷氨酰化（Acetylglutarylation）、丙?；≒ropionylation）、丁?；˙utyrylation）等：線粒體代謝衍生修飾

這些脂肪酸中間體衍生的修飾形式，廣泛發(fā)生于線粒體內(nèi)膜蛋白與代謝酶上。它們反映了細(xì)胞脂質(zhì)代謝活動水平，并通過競爭賴氨酸乙?；{(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性、染色質(zhì)狀態(tài)與細(xì)胞命運(yùn)。例如，丁酰化已被報(bào)道可調(diào)控p53依賴性凋亡過程。

這些修飾均存在位點(diǎn)交疊、質(zhì)量漂移重疊等識別難點(diǎn)，需結(jié)合特異富集策略與靶向碎片分析方法聯(lián)合鑒定。

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