支原體QPCR檢測，三復孔重復性不好的原因？

來源：上海翼和應用生物技術(shù)有限公司 2025年05月22日 15:15

復孔重復性不好，可能有以下幾種原因：

首先，判斷各個參數(shù)設置是否正確，例如是否扣除ROX（ABI系列機器）、基線和閾值線等；

其次，判斷內(nèi)參通道是否異常，判斷PCR反應是否正常進行；

第三，CT值是否落在35之后，這是熒光定量PCR反應的灰區(qū)，在這個區(qū)間的CT值重復性非常差；

第四，試劑盒本身問題，酶、引物探針、反應條件等優(yōu)化不完善；

第五，加樣誤差；

第六，儀器長時間未校準。

針對這幾種原因，進行逐一排查

第一種情況，排查各類參數(shù)設置，看看是否能夠解決問題；

第二種情況，如確實內(nèi)參通道CT值異常，明顯偏離說明書設定的范圍，則樣本中存在PCR抑制成分，需稀釋10倍或抽提核酸進行檢測；

第三種情況，需依據(jù)擴增曲線是否具備典型的S型來判斷，如兩次檢測均具備典型的S型擴增曲線，則判為支原體陽性，樣本發(fā)生了極其微弱的支原體污染；反之，則應為支原體陰性。

第四種情況，需要重新優(yōu)化試劑盒。

第五種情況，建議移液器定期校準，使用時規(guī)范操作。

第六種情況，儀器要定期校準。

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