一、實(shí)驗(yàn)步驟

1、分離

用PBS清洗脂肪組織，并將組織放在冰上的培養(yǎng)皿中，用剪刀將組織切成小塊（約3-5mm）。

將切碎的組織轉(zhuǎn)移到含有7mL冰冷消化緩沖液的10mL圓底管中，此操作需一直保持在冰上。對(duì)于>1g的脂肪，將組織切碎并轉(zhuǎn)移到含有10mL冰冷消化緩沖液的50mL錐形管中。

加入1mL（如脂肪組織重量>1g則可以增加至1.5mL）10× 膠原酶緩沖液，并加入消化緩沖液使得膠原酶的最終濃度為1mg/mL。

在37°C下孵育半小時(shí)，且使試管劇烈搖晃。每10分鐘大力搖動(dòng)試管，可獲得更高的細(xì)胞產(chǎn)量。30分鐘后，取10µL產(chǎn)物進(jìn)行顯微鏡觀察，此時(shí)，脂肪細(xì)胞應(yīng)顯示為大的單細(xì)胞，白細(xì)胞和其他基質(zhì)細(xì)胞會(huì)小得多。如果白細(xì)胞仍附著在脂肪細(xì)胞上，則應(yīng)繼續(xù)消化；如果沒有，請(qǐng)繼續(xù)下一步。

消化后，將EDTA添加到10 mM的最終濃度，并在37°C下再孵育10分鐘。

2、過濾

用 PBS預(yù)濕100 µm尼龍過濾器，然后放置在50mL錐形管上。使用移液管，將前述樣本的細(xì)胞沉淀先轉(zhuǎn)移到過濾器上過濾，然后再過濾含有脂肪細(xì)胞的上層。

加入10 ml FACS 緩沖液輕輕清洗過濾器兩次。

3、離心

在4 °C下以500×g 離心10分鐘以分離脂肪細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。離心后，脂肪細(xì)胞在頂部形成白色層，而巨噬細(xì)胞等其它細(xì)胞在管底部形成紅色或白色沉淀。

輕輕吸出并丟棄脂肪細(xì)胞和上清液。此時(shí)，含有巨噬細(xì)胞的團(tuán)塊很容易受到干擾，因此應(yīng)格外小心。

4、獲取巨噬細(xì)胞

通過輕彈試管將沉淀重懸于0.5 mL紅細(xì)胞裂解液中。在室溫下孵育5分鐘，偶爾輕輕搖晃。

通過添加5 mL FACS緩沖液，中和紅細(xì)胞裂解作用。

在4 °C下以500×g 離心10分鐘。

在3—5 mL FACS緩沖液中重懸細(xì)胞沉淀并在冰上孵育。

5、巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)

將10 µL每個(gè)樣品1:1與臺(tái)盼藍(lán)溶液混合。使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板仔細(xì)計(jì)數(shù)活細(xì)胞。根據(jù)計(jì)數(shù)得到的細(xì)胞數(shù)量，結(jié)合獲得的樣本總體積，可計(jì)算出每份脂肪組織巨噬細(xì)胞產(chǎn)量。典型的產(chǎn)量：瘦小鼠一般為1-3×1000000個(gè)細(xì)胞/g脂肪，肥胖小鼠一般為2-5×1000000個(gè)細(xì)胞/g脂肪。

二、注意事項(xiàng)

1、盡可能切碎組織，在消化過程中頻繁手動(dòng)搖動(dòng)增加接觸面積。

2、膠原酶消化脂肪組織時(shí)，碎組織大小、搖動(dòng)強(qiáng)度和孵育時(shí)間是關(guān)鍵參數(shù)，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，以限度地提高從脂肪提取巨噬細(xì)胞的產(chǎn)量。

3、膠原酶的消化時(shí)間應(yīng)根據(jù)每批膠原酶分別進(jìn)行優(yōu)化。增加膠原酶緩沖液中的孵育時(shí)間，尤其是超過1小時(shí)，會(huì)顯著降低細(xì)胞產(chǎn)量并增加細(xì)胞死亡幾率。

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