一、背景

細(xì)胞輻照培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)服務(wù)是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)平臺(tái)常見實(shí)驗(yàn)之一，需由經(jīng)驗(yàn)豐富的實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行操作。

細(xì)胞輻照指的是用X射線，β、γ射線等電離射線來輻射細(xì)胞的過程。放射治療作為治療腫瘤的重要手段，廣泛應(yīng)用于各種腫瘤的治療，具有療效確切，副作用小等優(yōu)點(diǎn)。然而在腫瘤進(jìn)行放射治療時(shí)，射線在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，不可避免的對(duì)腫瘤周圍正常組織、器官也產(chǎn)生一定的損傷。

為了提高放療對(duì)腫瘤的療效，減少射線對(duì)正常組織、器官的損傷，需要尋找一些輔助腫瘤治療的藥物。細(xì)胞輻照有利于在體外摸索的輻射強(qiáng)度，也在輻射增敏劑的研究中具有重要作用。此外，細(xì)胞輻照還可應(yīng)用于細(xì)胞損傷的研究。

二、實(shí)驗(yàn)技術(shù)原理

輻射會(huì)延長(zhǎng)細(xì)胞周期，誘導(dǎo)染色體畸變，從而使組織、細(xì)胞受到損傷。

三、實(shí)驗(yàn)操作流程

1、細(xì)胞培養(yǎng)

2、用指定的藥物處理細(xì)胞

3、待細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)，不同劑量的射線照射細(xì)胞

4、輻照細(xì)胞的培養(yǎng)

四、應(yīng)用

用于小鼠成骨細(xì)胞受X線輻照后培養(yǎng)上清液的蛋白芯片分析研究：

通過觀察不同劑量輻照對(duì)成骨細(xì)胞增殖分化及其分泌蛋白的影響,篩選輻射損傷可能的特異性蛋白并初步探討可能涉及的生物學(xué)過程及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,為更好地理解輻射對(duì)骨組織的生物學(xué)作用提供參考。

方法：

1、取體外培養(yǎng)的小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1,按輻照劑量分成0 Gy組、2 Gy組、4 Gy組、8 Gy組、16 Gy組5組,使用6 MV直線加速器分別予以X線輻照,觀察輻照后細(xì)胞形態(tài)的改變,CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,輻照后7 d檢測(cè)0 Gy組、2 Gy組、4 Gy組、8 Gy組細(xì)胞內(nèi)ALP活性及采用qPCR檢測(cè)細(xì)胞OPG、OCN、Runx2、ALP的mRNA表達(dá)水平。

2、小鼠成骨細(xì)胞輻照后7 d分別收集0 Gy組、2 Gy組、4 Gy組、8 Gy組細(xì)胞上清液,采用高通量蛋白芯片技術(shù)檢測(cè)分泌蛋白的表達(dá)情況,GO和KEGG pathway分析差異蛋白的生物學(xué)信息,并篩選出輻射劑量依賴性上調(diào)的差異蛋白,通過ELISA驗(yàn)證。

結(jié)果：

1、輻照后成骨細(xì)胞胞體腫大,細(xì)胞核變大,胞漿內(nèi)空泡增多,特別是核區(qū)附近出現(xiàn)黑色顆粒,貼壁能力減退,出現(xiàn)較多漂浮的細(xì)胞,隨著輻射劑量增加,上述改變愈加明顯。采用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,輻照后3 d、5 d和7 d,4個(gè)輻照組均導(dǎo)致成骨細(xì)胞增殖呈輻射劑量依賴性降低（P<0.05）。輻照后7 d,各輻照組細(xì)胞內(nèi)ALP活性均較對(duì)照組低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。2 Gy輻照未顯著引起成骨相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的變化;4 Gy以上輻照組較對(duì)照組OPG、Runx2和ALP基因的表達(dá)下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;而OCN基因的表達(dá)水平在4 Gy輻照時(shí)下調(diào),8 Gy輻照時(shí)顯著上調(diào)（P<0.05）。

2、成骨細(xì)胞輻照后上清液中共發(fā)現(xiàn)36個(gè)表達(dá)差異蛋白,GO及KEGG Pathway分析表明X線輻照成骨細(xì)胞后,多種炎癥細(xì)胞及免疫細(xì)胞被激活,細(xì)胞增殖、分化、遷移、趨化能力增強(qiáng),細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、細(xì)胞黏附信號(hào)、血管生成信號(hào)、TNF信號(hào)通路、JAK/STAT信號(hào)通路、ERK1和ERK2信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路等明顯富集。其中IL-22和TremL1的表達(dá)水平在3個(gè)輻射劑量下都存在差異,并且均表現(xiàn)為上調(diào)。RANTES呈輻射劑量依賴性表達(dá)上調(diào),ELISA驗(yàn)證成骨細(xì)胞輻照后RANTES表達(dá)水平顯著上調(diào)（P<0.05）。

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