手機版
化工儀器網手機版
化工儀器網小程序
官方微信
公眾號：chem17
掃碼關注視頻號
描述
數(shù)字PCR（DPCR）是一種核酸定量技術，能夠在單分子水平上對DNA或RNA進行絕對定量。與傳統(tǒng)的實時熒光定量PCR（qPCR）相比，DPCR具有更高的靈敏度和準確性，因此在生物學研究和臨床診斷中得到了廣泛應用。
DPCR腫瘤領域相關應用
DPCR腫瘤領域相關應用：
檢測Gene Expression，主要是檢測mRNA的定量分析;
檢測Mutation（SNV和Indel），可以檢測拷貝數(shù)，也可以檢測比率；
檢測CNV（拷貝數(shù)變異分析），相對定量；
檢測Fusion，可以檢測拷貝數(shù)，也可以檢測比率；
科佰生物
科佰生物針對以上應用開發(fā)對應的檢測試劑盒，配套科佰生物的參考品，對試劑盒做性能評價，如下我們以EGFR T790M為例：
實驗一：LOB空白限測試
待測樣本：20個陰性樣本和1個NTC。分別將投入量設置為10ng和40ng，每個樣本做兩個重復進行Bio-Rad數(shù)字PCR檢測。
由上數(shù)據(jù)可見：無論是10ng還是40ng，LOB控制在2拷貝以內（一般噪音拷貝為5以內），雜點不呈現(xiàn)劑量的依賴，是隨機產生的噪音信號。
實驗二：準確性測試
待測樣本：10個NGS驗證為陽性的樣本（編號1-10）; 10個NGS驗證為陰性的樣本（編號11-20）。對20個樣本分別使用數(shù)字PCR檢測。
由上數(shù)據(jù)可見：
①測試10個NGS陽性樣本,檢測結果均為陽性，陽性符合率100%，并定量檢出變異頻率。
②測試10個NGS陰性樣本,檢測結果均為陰性，陰性符合率100%，定值變異頻率均為0%。
實驗三：線性范圍測試
1、投入量與拷貝數(shù)、頻率之間的線性測試
首先選取50%突變頻率的EGFR T790M標準品(CBP10402)，該標準品是通過基因編輯，二等位基因，CN=2，編輯一條為mutation，一條為WT，經過理論值計算、Sanger測序、Bio-Rad DdPCR試劑盒（Assay ID: dHsaCP2000019）共同驗證，確認為50%的頻率。
1.1 投入量在0.1ng~200ng間設置10個梯度，進行數(shù)字PCR檢測（2復孔），分別考量FAM拷貝數(shù)與投入量是否線性相關、VIC拷貝數(shù)與投入量是否線性相關；
1.2 投入量在0.1ng~200ng間設置10個梯度，進行數(shù)字PCR檢測（2復孔），判斷是否滿足%AF=50±10%波動。
由上數(shù)據(jù)可見：
①200 ng投入量過大，拷貝數(shù)不呈現(xiàn)線性，雖然滿足45-55%范圍，但是不適合做單一通道的拷貝數(shù)判定；
②0.1 ng投入量過小，拷貝數(shù)不呈現(xiàn)線性，同時42.59%也低于45%，不適合做單一通道，也不適合做雙通道；
因此：范圍為0.5-100ng。
2、線性稀釋不同頻率理論值與檢測值的線性測試
根據(jù)以上結論，我們選取10ng作為進一步的%AF線性范圍探索，首先使用EGFR T790M的對應的陰性標準品，對50%的標準品進行有限稀釋，0.1%-50%間設置9個AF梯度，進行數(shù)字PCR檢測（2復孔）。
由上數(shù)據(jù)可見：在10ng的投入量下，AF%呈現(xiàn)非常好的線性稀釋，存在波動，但是都在誤差范圍內。
實驗四：檢測限測試
我們可以通過理論計算來預測下可能的檢測限范圍。當控制拷貝在15000（對應50ng input）以內時LOB數(shù)據(jù)是2，2/15000=0.0133%，預測檢測限為0.0200%。
在如此低頻的情況下，臨床適用場景適合ctDNA，一般來說臨床上10ml全血，一般中位值ctDNA是20-40ng，取低值20ng。20ng 理論值6000個拷貝數(shù)，2/6000=0.0333%，預測檢測限為0.0500%。
0.05%的誤差范圍是±50%，就是0.025-0.075%，因此我們選擇3個點，探尋LOD分別為 0.010%、0.050%、0.100%，要求95%檢出。
0.010%
對20個0.01%的樣本進行數(shù)字PCR檢測，觀察在0.005-0.015%以內是否達成95%檢出。
0.05%
對20個0.05%的樣本進行數(shù)字PCR檢測，觀察在0.025-0.075%以內是否達成95%檢出。
0.1%
對20個0.1%的樣本進行數(shù)字PCR檢測，觀察在0.05-0.15%以內是否達成95%檢出。
由上數(shù)據(jù)可見：選擇0.05%作為該檢測試劑盒的檢測限LOD。
實驗五：精密度測試
選取強陽性2%樣本20個，中陽性1%樣本20個，弱陽性0.2%樣本20個分別進行數(shù)字PCR檢測。
由上數(shù)據(jù)可見：強陽性2% 、中陽性1% 、弱陽性0.2%三種檢測體系下，誤差均在合理的范圍內，精密度良好。
實驗六：回收率測試
首先使用EGFR T790M的對應的陰性標準品，對50%的標準品進行有限稀釋，每個梯度使用陰性樣本兩倍稀釋，接著對11個樣本進行檢測。
由上數(shù)據(jù)可見：當AF在0.05%-50%范圍內，對應的回收率在80-120%范圍，符合預期。
實驗七：重復性測試
取10個不同AF（1%~50%）的標準品樣本，分別安排實驗員A、實驗員B在同一天，每人進行四次檢測。
由上數(shù)據(jù)可見：EGFR T790M檢測體系是穩(wěn)定可重復的檢出的。
實驗八：重現(xiàn)性測試
取10個不同AF（1%~50%）的標準品樣本，分別安排①實驗員A、實驗員B在同一天進行每人四次實驗測試；②實驗員A在第一天、第二天分別進行四次實驗測試；③實驗員A在第一天進行四次實驗測試，實驗員B在第二天進行四次實驗測試。
由上數(shù)據(jù)可見：EGFR T790M檢測體系是穩(wěn)定可重復的在不同人、不同時間檢出，重現(xiàn)的。
科佰生物已經開發(fā)了多款dPCR試劑盒檢測體系，并利用自身的標準品進行了性能驗證。可用于基因突變，融合，拷貝數(shù)變異等的檢測。同時，我們可以提供dPCR檢測的科研服務，基于其絕對定值、精準定量的強大優(yōu)勢，為客戶的樣本檢測提供優(yōu)質服務。
相關產品
免責聲明
- 凡本網注明“來源：化工儀器網”的所有作品，均為浙江興旺寶明通網絡有限公司-化工儀器網合法擁有版權或有權使用的作品，未經本網授權不得轉載、摘編或利用其它方式使用上述作品。已經本網授權使用作品的，應在授權范圍內使用，并注明“來源：化工儀器網”。違反上述聲明者，本網將追究其相關法律責任。
- 本網轉載并注明自其他來源（非化工儀器網）的作品，目的在于傳遞更多信息，并不代表本網贊同其觀點和對其真實性負責，不承擔此類作品侵權行為的直接責任及連帶責任。其他媒體、網站或個人從本網轉載時，必須保留本網注明的作品第一來源，并自負版權等法律責任。
- 如涉及作品內容、版權等問題，請在作品發(fā)表之日起一周內與本網聯(lián)系，否則視為放棄相關權利。
采購中心