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細(xì)胞因子實(shí)驗(yàn)過程如何完成標(biāo)記任務(wù)
巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）是一種19.02kDa的造血生長因子，含有162個(gè)氨基酸殘基。該蛋白的活性：形式為同源二聚體，由成骨細(xì)胞分泌。M-CSF可控制單核細(xì)胞、巨噬細(xì)f胞和骨髓祖細(xì)胞的生成、分化和功能。M-CSF能夠通過結(jié)合其受體CSF-1R激活CSF-1信號(hào)通路。
標(biāo)記：
1.將細(xì)胞培養(yǎng)基與EdU溶液按照500：1的比例混合，制成2×EdU標(biāo)記培養(yǎng)基。
2.提前將2×EdU標(biāo)記培養(yǎng)基預(yù)熱，然后將150微升2×EdU標(biāo)記培養(yǎng)基與等體積細(xì)胞培養(yǎng)基混合，獲得1×EdU溶液。
【注】：
①不建議替換全部培養(yǎng)基，這樣可能會(huì)影響細(xì)胞增殖的速度。
②配置好的培養(yǎng)基建議現(xiàn)用現(xiàn)配，用量以沒過細(xì)胞為宜。
3.孵育細(xì)胞2h，棄培養(yǎng)基。
【注】：
①培養(yǎng)時(shí)間取決于細(xì)胞的增殖速度和生長狀態(tài)。
②大多數(shù)腫瘤細(xì)胞以及粘附細(xì)胞系均可采用2h的孵育時(shí)間。
4.以1xPBS清洗細(xì)胞兩次，每次5min, 以除去未摻入DNA的EdU殘留。
【注】：對(duì)于貼壁不牢的細(xì)胞可降低清洗強(qiáng)度。
實(shí)驗(yàn)步驟：
1.將細(xì)胞以104-105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在96孔板中，加入100μL培養(yǎng)基，含或不含待測化合物。在CO2培養(yǎng)箱中在37℃下培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)。
2.向板中加入10μL不同濃度的待測物質(zhì)。
3.在培養(yǎng)箱中將培養(yǎng)板培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間（如6、12、24或48小時(shí)）。
4.向板的每個(gè)孔中加入10μL CCK-8溶液。小心不要將氣泡引入孔中。
5.將平板在培養(yǎng)箱中孵育1-4小時(shí)。
6.在讀板之前，在定軌振蕩器上輕輕混勻。
7.使用酶標(biāo)儀測量450nm處的吸光度。
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