7月13日，由石河子大學(xué)動物科技學(xué)院皮文輝研究員團(tuán)隊(duì)培育的兩只羊?qū)殞殹皬?qiáng)強(qiáng)”“壯壯”迎來滿月。皮教授團(tuán)隊(duì)使用NEPA21高效基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)（NEPA GENE），通過電穿孔技術(shù)將Cas9 RNPs成分遞送入綿羊體外受精胚胎，成功敲除了肌肉生長抑制素（MSTN）基因，從而獲得了具有更好肌肉品質(zhì)和更高產(chǎn)肉量的基因編輯綿羊。

此學(xué)術(shù)論文已在國際科學(xué)期刊《International Journal of Molecular Sciences》上發(fā)表，題為“Electroporation Delivery of Cas9 sgRNA Ribonucleoprotein Mediated Genome Editing in Sheep IVF Zygotes”。

目前，顯微注射和電穿孔是兩種常用于將CRISPR/Cas9傳遞到哺乳動物受精卵中的技術(shù)。雖然顯微注射技術(shù)精確且可重復(fù)，但它操作復(fù)雜，每次注射的目標(biāo)有限，成本昂貴并且需要廣泛的技術(shù)培訓(xùn)，不適合大規(guī)模應(yīng)用。相比之下，電穿孔技術(shù)作為一種更高效、可擴(kuò)展的基因組編輯方法正逐步流行，它簡化了操作過程，提高了胚胎存活率、轉(zhuǎn)染率和發(fā)育潛力。多種動物模型，包括大鼠、小鼠、牛和豬，已經(jīng)成功地通過電穿孔CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行了基因修飾。

在本研究中，作者設(shè)計(jì)了五個實(shí)驗(yàn)，以羊的ACTG1和MSTN基因?yàn)閷ο?，通過使用NEPA21高效基因電轉(zhuǎn)染系統(tǒng)（NEPA GENE）探索了不同電轉(zhuǎn)染參數(shù)對基因編輯效率的影響。在實(shí)驗(yàn)1中，研究者設(shè)置了三組不同的電穿孔參數(shù)（40V,3.5ms；41V,3.5ms；42V,3ms）來研究它們對綿羊受精卵分裂和囊胚形成率的影響（見表1和圖1）。他們使用sf-Cas9 RNPs靶向綿羊的ACTG1基因位點(diǎn)，并評估了在三種不同電穿孔參數(shù)下的基因編輯效率。電穿孔在受精后6小時進(jìn)行，結(jié)果顯示，最佳的電穿孔電壓和脈沖長度組合為40~42V和3.0~3.5ms。此外，更強(qiáng)的電場可能需要配合更短的脈沖持續(xù)時間，以實(shí)現(xiàn)高效基因編輯而不損傷受精卵。

圖1.針對綿羊ACTG1基因的靶向后，分裂和囊胚率（均值±標(biāo)準(zhǔn)差）。不同字母表示顯著差異（p<0.05）。藍(lán)色條表示IVF后的受精卵分裂率。綠色條表示囊胚形成率。

在實(shí)驗(yàn)2中，作者探究了三種不同的Cas9 RNPs組分對綿羊電穿孔受精卵突變的影響。作者使用了40V、3.5ms的電穿孔參數(shù)，直接電轉(zhuǎn)染與sgRNA預(yù)孵育的sf-Cas9 RNPs，發(fā)現(xiàn)這可以提高基因編輯效率。結(jié)果表明，Cas9 RNPs中sgRNA的高飽和度能顯著提高基因編輯的成功率。研究者比較了三組不同成分RNP轉(zhuǎn)染后囊胚編輯效率：

1、單獨(dú)使用自組裝Cas9 RNPs的組別，突變效率為30.28%±9.14%（見圖2）。

2、使用合成靶向sgRNAs預(yù)孵育的sf-Cas9 RNPs組別（sf-Cas9 RNPs+sgRNA），突變效率顯著更高，達(dá)到87.78% ±10.72%（見圖2）。

3、entirely體外組裝的Cas9 RNPs組別，效率為82.14%±15.57%（見圖2）。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在進(jìn)行電穿孔之前，將Cas9蛋白與sgRNA預(yù)先孵育，可以顯著提高綿羊受精卵基因編輯的突變效率。

圖2.三種Cas9 RNPs對綿羊囊胚編輯突變率的影響（ACTG1位點(diǎn)）

在實(shí)驗(yàn)3中，作者通過電穿孔傳遞Cas9 RNPs至綿羊MSTN基因位點(diǎn)，提高了突變效率。使用體外組裝的Cas9 RNPs，并設(shè)置了兩組不同的電穿孔參數(shù)：（40V,3.5ms）和（42V,3ms），將Cas9 RNPs轉(zhuǎn)染到綿羊受精卵中。結(jié)果顯示，電穿孔顯著提高了綿羊囊胚中基因組靶標(biāo)的突變率，且這種增加是顯著的（p<0.01，見圖3）。在這兩組電穿孔參數(shù)下，有非常高比例的囊胚表現(xiàn)出突變，突變率分別為84.55%±1.19%和82.83%±0.87%（見圖3）。

這些發(fā)現(xiàn)表明，所測試的兩組電穿孔參數(shù)都適合于IVF綿羊受精卵的基因編輯，能夠有效地提高基因編輯的效率。

圖3.綿羊MSTN基因靶向后的突變率（均值±標(biāo)準(zhǔn)差）

在實(shí)驗(yàn)4中，作者探索了Cas9 RNPs和單鏈寡核苷酸（ssODNs）的結(jié)合對綿羊胚胎基因編輯的影響。作者使用了40V、3.5ms的電穿孔參數(shù)來傳遞以下混合物：Cas9蛋白（200ng/µL）、針對MSTN基因位點(diǎn)的sgRNA（300ng/µL）、含有由同源序列flanked的EcoR I和EcoR V位點(diǎn)的ssODNs（420ng/µL），電穿孔后，研究者提取了模板DNA用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增。然后，他們使用基于PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果來分析綿羊囊胚的基因分型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小的DNA片段可以通過與Cas9 RNPs的電穿孔有效地插入到綿羊受精卵的目標(biāo)區(qū)域。ssODNs的引入導(dǎo)致囊胚中26%的同源重組率，其中2%的囊胚為純合子。此外，研究還發(fā)現(xiàn)增加ssODNs的長度可以進(jìn)一步提高同源重組的效率。

在實(shí)驗(yàn)5中，研究者將經(jīng)過MSTN基因編輯的囊胚轉(zhuǎn)移到受體母羊中。移植成功并生產(chǎn)了兩只雄性羔羊（見圖4）。其中，羔羊1具有斑點(diǎn)毛色，而羔羊2則是純白色。對這兩只羔羊的MSTN基因進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示它們的突變率異常高，分別為94.5%和94.9%。這表明通過電穿孔技術(shù)處理IVF綿羊受精卵進(jìn)行基因編輯是成功的。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了CRISPR/Cas9系統(tǒng)在誘導(dǎo)羔羊中遺傳修飾方面的高效性。MSTN基因是肌肉生長的一個關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，因此該基因的成功編輯可能對提高綿羊的肌肉質(zhì)量和改善其生產(chǎn)性狀具有重要意義。此外，這項(xiàng)研究表明電轉(zhuǎn)染技術(shù)有潛力成為綿羊養(yǎng)殖業(yè)中基因組編輯和育種的有效工具，為未來在畜牧業(yè)中應(yīng)用基因編輯技術(shù)提供了有力的證據(jù)。

圖4.出生20天后的基因編輯羔羊

NEPA21高效基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)采用全新設(shè)計(jì)的電轉(zhuǎn)程序，配合電壓衰減設(shè)計(jì)，在獲得高轉(zhuǎn)染效率的同時，提高細(xì)胞存活率。操作簡單，電轉(zhuǎn)參數(shù)可見可調(diào)，適用性強(qiáng)。特別適用于難轉(zhuǎn)染的原代免疫細(xì)胞、干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、活體動物、受精卵及宮內(nèi)胚胎等的轉(zhuǎn)染，多篇文獻(xiàn)支持！咨詢可識別下方二維碼。

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