手機(jī)版
化工儀器網(wǎng)手機(jī)版
化工儀器網(wǎng)小程序
官方微信
公眾號：chem17
掃碼關(guān)注視頻號
多篇Science/ Nature齊發(fā)！類器官研究與發(fā)育生物學(xué)迎來“史詩級”技術(shù)革新
近期，來自瑞士Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research研究所的P. Liberali組與Viventis公司工程師合作，使用長時間高分辨類器官光片顯微鏡-LS2在bioRxiv上在線發(fā)表了題為Open top multi sample dual view light sheet microscope for live imaging of large multicellular systems的文章。這篇文章對該技術(shù)的核心細(xì)節(jié)進(jìn)行詳盡展示。
長時間高分辨類器官光片顯微鏡-LS2是由瑞士Viventis公司推出的一款全新光片成像平臺，可實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞的長時間、高分辨、高通量、多樣品同時成像，非常適合對直徑達(dá)300 μm的光敏樣品（如卵母細(xì)胞，胚胎和類器官）進(jìn)行長期實(shí)時高時空分辨率和低光毒性的觀察與成像。該技術(shù)一經(jīng)推出便已發(fā)布多篇Science/ Nature主刊 [1-5]。
長時間高分辨類器官光片顯微鏡-LS2是由瑞士Viventis公司推出的一款全新光片成像平臺，可實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞的長時間、高分辨、高通量、多樣品同時成像，非常適合對直徑達(dá)300 μm的光敏樣品（如卵母細(xì)胞，胚胎和類器官）進(jìn)行長期實(shí)時高時空分辨率和低光毒性的觀察與成像。該技術(shù)一經(jīng)推出便已發(fā)布多篇Science/ Nature主刊 [1-5]。
長時間高分辨類器官光片顯微鏡-LS2腸道類器官成像效果
摘要：
多細(xì)胞系統(tǒng)會在數(shù)周內(nèi)從單個細(xì)胞生長成為類器官、由數(shù)千個細(xì)胞組成完整組織，此類樣品的實(shí)時成像一直具有挑戰(zhàn)性。為了跨越這些長時間、空間尺度的難題，本文作者提出了一種開放式頂部雙側(cè)成像和雙側(cè)照明的光片顯微鏡，專門用于單細(xì)胞分辨率的發(fā)育過程中的大型樣本的實(shí)時成像。作者使用新開發(fā)的光片顯微鏡對多種樣品進(jìn)行實(shí)時成像研究，結(jié)果突出顯示了其在大型標(biāo)本(如成熟的腸道類器官等)中獲得定量單細(xì)胞信息的能力。
研究背景：
單個細(xì)胞發(fā)育成為復(fù)雜組織的動力學(xué)、可視化以及潛在分子機(jī)制的理解是細(xì)胞和發(fā)育生物學(xué)的首要目標(biāo)。然而，這些復(fù)雜的生物現(xiàn)象往往跨越大的空間和時間生物學(xué)尺度，特別是類器官等體外模型系統(tǒng)，經(jīng)常受到樣品間異質(zhì)性的影響。設(shè)計用于此類系統(tǒng)實(shí)時成像的顯微鏡需要在每個實(shí)驗(yàn)中提供高樣品通量才能得出結(jié)論，且需要為光散射較大的樣品提供足夠的空間和時間分辨率和高圖像質(zhì)量，同時最大限度地減少光劑量并保持樣品上樣方便。目前，大多數(shù)的光片顯微鏡技術(shù)由于其低光毒性成為了克服上述一些挑戰(zhàn)的技術(shù)方案之一。但這些技術(shù)僅限于每次實(shí)驗(yàn)僅對一個或極少數(shù)樣品進(jìn)行成像，且這些系統(tǒng)缺乏從對側(cè)進(jìn)行多視成像的可能性，不適合發(fā)育較大的樣本。
文章亮點(diǎn)：
本文展示了一種開放式、雙側(cè)成像和雙照明的長時間高分辨類器官光片顯微鏡-LS2。其結(jié)合了多視圖光片顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)，具有開放式幾何形狀和多孔樣品支架，可以對大型多細(xì)胞系統(tǒng)進(jìn)行長期多位置3D實(shí)時成像。作者通過對小鼠腸道、肝臟和唾液腺類器官、類原腸胚、水螅和人結(jié)腸癌類器官的長期實(shí)時成像，展示了該系統(tǒng)在各種模型系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)高圖像質(zhì)量的能力，其尺寸可達(dá)550 μm，記錄時間長達(dá)12天。此外，本文獲得了跨生物尺度的定量特征，并通過對腸道類器官和類原腸胚的跟蹤和分割提供了詳細(xì)的單細(xì)胞分析，這是新開發(fā)的Viventis長時間高分辨類器官光片顯微鏡-LS2才能實(shí)現(xiàn)的。
詳細(xì)數(shù)據(jù)：
本文展示的光片顯微鏡包含兩顆相對的照明物鏡(尼康10X, NA 0.2)，每顆從水平面略微向上傾斜，從兩個側(cè)面照亮樣品，兩顆相對的成像物鏡從兩個方向成像(尼康16X, NA 0.8， 該系統(tǒng)也兼容尼康25X, NA 1.1)(圖1)。這種幾何形狀在兩個照明物鏡上方創(chuàng)造了一個無阻的線性空間用于定制設(shè)計的多孔樣本池(圖1-2)，該樣本池包含多達(dá)四個可互換的樣品室陣列， 用于多位置成像。浸入介質(zhì)被放置在一個儲層中，填充兩個水浸入檢測物鏡之間的空間。 為了獲得兩個相對的光片以盡可能大的角度照亮樣品,作者使用了超長工作距離的空氣物鏡， 通過玻璃窗將照明光耦合到浸入介質(zhì)中，并設(shè)計了一個定制的校正三重透鏡來補(bǔ)償球面和色差。物鏡區(qū)域是具溫度控制的，樣品被封閉在一個控制CO2濃度的隔間中。額外的光束路徑是使用其中一個檢測物鏡作為聚光鏡來照亮樣品并獲取透射光圖像。為了以最佳方式安裝不同的生物樣品，作者在熱成型過程中開發(fā)了由氟乙烯丙烯(FEP)箔制成的可定制腔室。該腔室適合于兩顆檢測物鏡之間的6毫米空間區(qū)域，并允許從頂部加液、移液，滿足不同生物樣品的活細(xì)胞培養(yǎng)要求。
圖1 長時間高分辨類器官光片顯微鏡-LS2光路圖
圖2 長時間高分辨類器官光片顯微鏡-LS2物鏡及樣本池視圖
在作者之前的工作中，使用了本文所介紹的顯微鏡的前身，上一代技術(shù)的顯微鏡只構(gòu)建了一個檢測物鏡來跟蹤發(fā)育中的腸道類器官中的細(xì)胞。 然而，所提供的成像深度不足以跟蹤較大標(biāo)本中的細(xì)胞，包括成熟的類器官。新設(shè)計的雙成像物鏡、雙側(cè)照明方法克服了這一障礙。 作者使用細(xì)胞周期報告基因FUCCI2，在3天的時間過程中對成熟小鼠腸道類器官的隱窩和絨毛形成進(jìn)行成像(圖2和視頻2)。 在隱窩和絨毛形成的背景下監(jiān)測細(xì)胞周期狀態(tài)。 使用多位置成像，同時獲得了多個類器官的數(shù)據(jù)集。單細(xì)胞分辨率的雙色成像深度為360µm， 時間分辨率為10分鐘(視頻1)，以非常細(xì)致的細(xì)節(jié)顯示發(fā)育中的小鼠腸道類器官的整體動力學(xué)。整個單細(xì)胞的可視化樣本量要求通過雙側(cè)成像實(shí)現(xiàn)高圖像質(zhì)量。我們通過將單個檢測物鏡的XZ部分與融合數(shù)據(jù)進(jìn)行比較來說明這一點(diǎn)(圖2)。 隨著成像深度的增加， 單個視圖的切片顯示出預(yù)期的退化，而融合的數(shù)據(jù)由兩個視圖的最佳質(zhì)量組合組成，并且能夠在整個體積中繪制單個細(xì)胞(視頻2)。這種策略對于整個樣本的3D成像是十分必要的。
小鼠腸道類器官的隱窩和絨毛形成
為了進(jìn)一步評估使用兩個相對的成像物鏡對圖像質(zhì)量的改善，作者通過計算兩個物鏡的每個z截面的離散余弦變換DCT來比較圖像質(zhì)量隨成像深度的增加。例如，對腸道和人類結(jié)腸癌類器官進(jìn)行了比較(圖3)。兩種模型系統(tǒng)都顯示，隨著成像深度和距離檢測物鏡的距離增加，圖像質(zhì)量明顯下降，這可以通過組合來自兩個相反物鏡的數(shù)據(jù)來補(bǔ)償。綜上所述，雙重檢測物鏡對于保證大樣本的高圖像質(zhì)量的重要性。
圖3 腸道和人類結(jié)腸癌類器官成像及單細(xì)胞分析
為了說明新發(fā)布系統(tǒng)的高性能，作者對尺寸從200µm到550µm的多種樣品進(jìn)行了成像，并進(jìn)行了長達(dá)12天的連續(xù)成像：小鼠肝類器官，人類結(jié)腸癌類器官，小鼠腮腺唾液腺類器官，和類原腸胚。此外，新發(fā)布系統(tǒng)的樣品安裝策略不僅支持各種不同標(biāo)本的開發(fā)，而且可以進(jìn)行平行化學(xué)擾動的實(shí)驗(yàn)。在相同的成像實(shí)驗(yàn)中，四個腔室中的每一個都可以用于特定的條件，每個腔室內(nèi)有許多單獨(dú)的位置成像。我們分析了PGE、Forskolin和NaCl誘導(dǎo)的高滲休克對腸道類器官的機(jī)械滲透作用。3分鐘的高時間分辨率(視頻3)顯示了對各自治療的快速類器官膨脹和收縮。
平行的PGE、Forskolin和NaCl對腸道類器官的影響
此外，為了證明新發(fā)布顯微鏡的多定位能力，作者以10分鐘的時間分辨率對25個成熟的腸道類器官進(jìn)行了平行成像，每個類器官的體積為360 µm(視頻4)。
.png)
總結(jié)：
本文作者提出并發(fā)布了一種雙側(cè)成像、 雙側(cè)照明的光片顯微鏡，適用于單細(xì)胞分辨率下對多種大型生物模型系統(tǒng)(如腸道類器官等)進(jìn)行長期多位置成像，質(zhì)量適合于整個類器官的細(xì)胞分割和細(xì)胞跟蹤。特殊的物鏡配置使得使用多孔樣品池可以同時監(jiān)測多個實(shí)驗(yàn)條件。通過采用熱成型工藝制造各種形狀的樣品池實(shí)現(xiàn)了樣品特定和靈活的上樣。未來，具有這種物鏡配置和樣本池配置的光片顯微鏡將進(jìn)一步成為技術(shù)進(jìn)步的有前途的平臺。
參考文獻(xiàn)：
[1] Naganathan et al., Left-right symmetry of zebrafish embryos requires somite surface tension. Nature
[2] So et al., Mechanism of spindle pole organization and instability in human oocytes. Science
[3] He et al., Lineage recording in human cerebral organoids. Nature Methods
[4] Serra et al., Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoids development. Nature
[5] Dumortier et al., Fracking and Ostwald ripening position the lumen of the mouse blastocyst. Science
相關(guān)產(chǎn)品
1、長時間高分辨類器官光片顯微鏡-LS2
1、長時間高分辨類器官光片顯微鏡-LS2
相關(guān)產(chǎn)品
免責(zé)聲明
- 凡本網(wǎng)注明“來源：化工儀器網(wǎng)”的所有作品，均為浙江興旺寶明通網(wǎng)絡(luò)有限公司-化工儀器網(wǎng)合法擁有版權(quán)或有權(quán)使用的作品，未經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)不得轉(zhuǎn)載、摘編或利用其它方式使用上述作品。已經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)使用作品的，應(yīng)在授權(quán)范圍內(nèi)使用，并注明“來源：化工儀器網(wǎng)”。違反上述聲明者，本網(wǎng)將追究其相關(guān)法律責(zé)任。
- 本網(wǎng)轉(zhuǎn)載并注明自其他來源（非化工儀器網(wǎng)）的作品，目的在于傳遞更多信息，并不代表本網(wǎng)贊同其觀點(diǎn)和對其真實(shí)性負(fù)責(zé)，不承擔(dān)此類作品侵權(quán)行為的直接責(zé)任及連帶責(zé)任。其他媒體、網(wǎng)站或個人從本網(wǎng)轉(zhuǎn)載時，必須保留本網(wǎng)注明的作品第一來源，并自負(fù)版權(quán)等法律責(zé)任。
- 如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問題，請?jiān)谧髌钒l(fā)表之日起一周內(nèi)與本網(wǎng)聯(lián)系，否則視為放棄相關(guān)權(quán)利。
采購中心