| 供貨周期 |
一個月 |
應(yīng)用領(lǐng)域 |
化工,生物產(chǎn)業(yè),制藥/生物制藥 |
人可溶性粘附分子試劑盒，基于雙抗夾心 ELISA 法測樣本該分子含量。操作經(jīng)樣本準備等多步，各環(huán)節(jié)有嚴格要求，保障檢測結(jié)果精準可靠 。
人可溶性粘附分子試劑盒
人可溶性粘附分子試劑盒，在醫(yī)學研究與臨床檢測領(lǐng)域扮演關(guān)鍵角色，主要用于精準測定人血清、血漿、細胞培養(yǎng)上清等樣本中的可溶性粘附分子含量。可溶性粘附分子在細胞間信號傳導(dǎo)、炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)以及腫瘤轉(zhuǎn)移等生理病理過程中發(fā)揮重要作用，對其含量的檢測有助于深入探究相關(guān)疾病的發(fā)病機制、病情評估及治療效果監(jiān)測。
一、檢測原理
該試劑盒通常采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）原理。在試劑盒的酶標板孔內(nèi)，預(yù)先包被有針對人可溶性粘附分子的特異性捕獲抗體。檢測時，將標準品與待測樣本依次加入酶標板孔。樣本中的可溶性粘附分子會迅速與包被在孔壁上的捕獲抗體特異性結(jié)合。溫育一段時間，確保結(jié)合反應(yīng)充分后，通過洗滌操作去除未結(jié)合的雜質(zhì)。隨后，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體，其能與已結(jié)合在捕獲抗體上的可溶性粘附分子再次特異性結(jié)合，從而形成 “捕獲抗體 - 可溶性粘附分子 - 酶標檢測抗體" 的穩(wěn)定免疫復(fù)合物。再次洗滌，清除未參與反應(yīng)的多余酶標檢測抗體。緊接著，向各孔中添加底物 TMB。在 HRP 的催化作用下，原本無色的 TMB 底物發(fā)生化學反應(yīng)，逐步轉(zhuǎn)變?yōu)樗{色產(chǎn)物。反應(yīng)持續(xù)一段時間后，加入終止液，使反應(yīng)迅速停止，此時溶液顏色由藍色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。溶液顏色的深淺與樣本中可溶性粘附分子的含量呈正相關(guān)，借助酶標儀在 450nm 波長下測量各孔溶液的吸光度（OD 值），依據(jù)標準品的 OD 值繪制出標準曲線，即可精準推算出待測樣本中可溶性粘附分子的濃度。
二、操作步驟
樣本準備：血清樣本采集后，需在 1000×g 的條件下離心 10 分鐘，小心分離出血清；血漿樣本同樣按此離心條件處理，注意要依據(jù)不同抗凝劑要求規(guī)范采集；細胞培養(yǎng)上清液則需以 1000×g 離心 10 分鐘，去除其中的細胞碎片和其他不溶性雜質(zhì)。若樣本不立即使用，應(yīng)分成小份，在 - 20℃或 -80℃環(huán)境下保存，防止反復(fù)凍融，使用前需在室溫下緩慢充分解凍并確保均勻。
試劑準備：從冰箱取出試劑盒后，需將所有試劑在室溫下平衡 30 - 60 分鐘，使試劑溫度與室溫一致，并充分混勻。同時，依據(jù)實驗所需檢測的樣本數(shù)量，確定酶標板的使用條數(shù)，標準品孔和空白孔建議設(shè)置復(fù)孔，以提高檢測結(jié)果的準確性與可靠性。此外，要按照說明書要求，用蒸餾水將濃縮洗滌液準確稀釋成工作洗滌液。
加樣：在酶標板上精確設(shè)置標準品孔、空白孔與待測樣本孔。向標準品孔中加入 50μL 已稀釋好的不同濃度標準品，濃度梯度需嚴格按照試劑盒說明書進行配置；待測樣本孔加入 50μL 處理好的樣本；空白孔則不加任何試劑。加樣時，務(wù)必使用微量加樣器，并確保加樣量準確，將樣本或標準品加于酶標板孔底部，盡量避免觸及孔壁，加樣后輕輕振蕩酶標板，使液體充分混勻。
溫育與洗滌：加樣完成后，用封板膜將酶標板密封，放置在 37℃恒溫培養(yǎng)箱中溫育相應(yīng)時間，具體溫育時長參照試劑盒說明書。溫育結(jié)束后，小心揭去封板膜，甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩 30 - 60 秒后，甩去洗滌液，并用吸水紙拍干，此洗滌操作需重復(fù) 4 - 5 次，以確保充分去除未結(jié)合物質(zhì)。若使用洗板機進行洗滌，需提前按照儀器操作規(guī)程進行設(shè)置，且洗滌次數(shù)應(yīng)適當增加 1 - 2 次。
后續(xù)反應(yīng)與檢測：每孔加入 100μL HRP 標記的檢測抗體，輕輕振蕩混勻，再次用封板膜密封，37℃溫育 30 分鐘。溫育結(jié)束后，重復(fù)上述洗滌步驟。接著，每孔依次加入底物 A、B 各 50μL，輕輕振蕩混勻，避免產(chǎn)生氣泡，37℃避光顯色 15 - 20 分鐘。顯色反應(yīng)結(jié)束后，迅速向每孔加入 50μL 終止液，加入終止液后應(yīng)立即使用酶標儀在 450nm 波長處測定各孔的 OD 值。依據(jù)標準曲線，計算出樣本中可溶性粘附分子的濃度，若樣本進行過稀釋，還需乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)得到實際濃度。
三、注意事項
試劑盒中的所有試劑在使用前必須充分平衡至室溫，避免因溫度差異影響檢測結(jié)果的準確性。同時，試劑使用后應(yīng)及時放回冰箱冷藏保存，防止試劑變質(zhì)。
樣本采集、處理過程務(wù)必嚴格遵循規(guī)范操作，防止樣本受到污染或發(fā)生溶血、脂血等情況，以免干擾檢測結(jié)果。如血清樣本應(yīng)避免溶血，紅細胞溶解時釋放出的具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，可能會增加以 HRP 為標記的 ELISA 測定中的非特異性顯色。
洗滌過程至關(guān)重要，既要確保充分去除雜質(zhì)和未結(jié)合物質(zhì)，又要避免過度洗滌導(dǎo)致已結(jié)合的物質(zhì)脫落。洗滌液的配制應(yīng)準確無誤，洗滌次數(shù)和時間需嚴格按照說明書執(zhí)行。
加樣操作要精準、迅速，盡量縮短各孔之間的加樣時間間隔，保證實驗條件的一致性。使用加樣器時，需定期校準，確保加樣量的準確性。
顯色反應(yīng)過程需嚴格控制時間和溫度，避免光線直射，以保證顯色效果的穩(wěn)定性。加入終止液后，應(yīng)盡快進行 OD 值測定，一般建議在 15 分鐘以內(nèi)完成，防止結(jié)果出現(xiàn)偏差。
實驗過程中使用的所有耗材，如酶標板、吸頭、試管等，應(yīng)確保無污染且質(zhì)量可靠，避免對實驗結(jié)果造成影響。
若對檢測結(jié)果存在疑問或出現(xiàn)異常情況，應(yīng)及時檢查實驗操作過程、試劑狀態(tài)以及儀器性能等，必要時可重復(fù)實驗進行驗證。
化工儀器網(wǎng)