木質(zhì)素過(guò)氧化物酶（Lignin peroxidase，Lip）試劑盒說(shuō)明書

分光光度法 50 管/48 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

木質(zhì)素過(guò)氧化物酶（EC1.11.1.14）是一種含亞鐵血紅素的過(guò)氧化物酶，屬于木質(zhì)素降解酶系，在木質(zhì)

素生物降解、造紙工業(yè)、紡織工業(yè)、芳香化合物轉(zhuǎn)化與降解及環(huán)境污染控制等方面具有較大的應(yīng)用潛力。

測(cè)定原理：

木質(zhì)素過(guò)氧化物酶催化天青脫甲基，在 651nm 處測(cè)定吸光值減少。

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試劑組成和配制：

試劑一：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 80ml 蒸餾水充分溶解待用，用不完的試劑 4℃保存 1 個(gè)月；

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書的參數(shù)為準(zhǔn)

需自備儀器和用品：

天平、研缽、低溫離心機(jī)、分光光度計(jì)、1 ml 玻璃比色皿、可調(diào)式移液器、冰。

酶液提取：

1、組織：按照質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g，加入 1ml 試劑一）加入試劑一，冰浴勻漿后于 4℃，10000g 離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。

2、細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：試劑一體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入1ml 試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后 4℃，10000g離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3、培養(yǎng)液或其它液體：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 651nm，蒸餾水調(diào)零。

2、臨用前按每個(gè)樣本試劑一：試劑二：試劑三= 400:200:200（μl）的比例配制工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

3、在 1ml 玻璃比色皿中依次加入如下試劑

充分混勻，立即測(cè)定 651nm 處 10s 和 130s 吸光值，記為A1 和A2，△A=A1- A2

酶活計(jì)算公式：

1．按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：每mg 組織蛋白在每ml 反應(yīng)體系中每分鐘A651 變化 0.02 為一個(gè)酶活力單位。

LiP 活性（U/mg prot）= ΔA×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷0.02÷T =125×ΔA÷Cpr 2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：每g 組織在每ml 反應(yīng)體系中每分鐘 A651 變化 0.02 為一個(gè)酶活力單位。

LiP 活性（U/g 鮮重）＝ΔA×V 反總÷(W× V 樣÷V 樣總)÷0.02÷T =125×ΔA÷W 3．按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每 ml 反應(yīng)體系中每分鐘A651 變化 0.02 為一個(gè)酶活力單位。

LiP 活性（U/104 cell）＝ΔA×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總)÷0.02÷T =0.25×ΔA 4．按照液體體積計(jì)算

酶活性定義：每ml 血清（漿）在每 ml 反應(yīng)體系中每分鐘A651 變化 0.02 為一個(gè)酶活力單位。

LiP 活性（U/ml）=ΔA×V 反總÷V 樣÷0.02÷T =125×ΔA

V 反總：反應(yīng)總體積，1ml；V 樣：反應(yīng)中樣本體積，0.2ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，2min

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