亮an酸氨基肽酶（Leucine Aminopeptidase, LAP）試劑盒說明書

微量法 100 管/96 樣

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

LAP 是一類能水解肽鏈N-末端為亮an酸的酶，廣泛存在于肝、腎、胰等組織中，尤其以肝臟中含量最為豐富。各類肝病患者因肝細(xì)胞損傷，血清LAP 的活性均有不同程度的升高，因此，血清 LAP 活性的檢測能從不同側(cè)面反映各種肝病的發(fā)生和發(fā)展。

測定原理：

LAP 分解L-亮an酰對硝基苯胺生成對硝基苯胺，后者在 405nm 有最大吸收峰，通過測定吸光值升高速率來計算LAP 活性。

亮an酸氨基肽酶試劑盒 氨基酸系列-常備現(xiàn)貨

組成：

自備儀器和用品：

酶標(biāo)儀/可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、96 孔板/微量石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

樣品的前處理：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個）：提取液體積（ml）為 1000~5000：1 的比例（建議 2000 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

LAP 測定步驟：

1、分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 405nm，蒸餾水調(diào)零。

2、將試劑二轉(zhuǎn)移至試劑一中充分溶解（如較難溶解，可 50℃水浴加熱約 30min 促進溶解）；在 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴 10min 以上；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

3、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 50μl 樣本和 150μl 試劑一，混勻后立即記錄 405nm 處初始吸光值A1 和 2min 后的吸光值A2，計算ΔA=A2-A1。

注意事項：若ΔA 大于 0.5，需將酶液用提取液稀釋，計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。使 A2-A1 小于0.5，可提高檢測靈敏度。

LAP 活力單位的計算：

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、血清（漿）LAP 活力的計算:

單位的定義：每ml 血清（漿）每分鐘生成 1 nmol 的對硝基苯胺定義為一個酶活力單位。

LAP（nmol/min/ml）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷V 樣÷T=205.8×ΔA 2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中LAP 活力的計算:

（1） 按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol 對硝基苯胺定義為一個酶活力單位。

LAP（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=205.8×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g 組織每分鐘生成 1 nmol 對硝基苯胺定義為一個酶活力單位。

LAP（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T=205.8×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol 對硝基苯胺定義為一個酶活力單位。

LAP（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(2000×V 樣÷V 樣總) ÷T=0.103×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：對硝基苯胺摩爾消光系數(shù)，9.72×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.05 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；2000：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，2000 萬。

b. 用 96 孔板測定的計算公式如下

1、血清（漿）LAP 活力的計算:

單位的定義：每ml 血清（漿）每分鐘生成 1 nmol 的對硝基苯胺定義為一個酶活力單位。

LAP（nmol/min /ml）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷V 樣÷T=411.5×ΔA 2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中LAP 活力的計算:

（1） 按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol 對硝基苯胺定義為一個酶活力單位。

LAP（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷ (V 樣×Cpr) ÷T=411.5×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g 組織每分鐘生成 1 nmol 對硝基苯胺定義為一個酶活力單位。

LAP（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T=411.5×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol 對硝基苯胺定義為一個酶活力單位。

LAP（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(2000×V 樣÷V 樣總) ÷T=0.206×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：對硝基苯胺摩爾消光系數(shù)，9.72×10³ L / mol /cm；d：96 孔板光徑，0.5cm；V 樣：加入樣本體積，0.05 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時間，2min； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；2000：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，2000 萬。

GOT（nmol/min/mg prot）=[（ΔA+0.0013）÷0.2384×V1]÷(V1×Cpr)÷T×10³ =209.7×（ΔA+0.0013）÷

Cpr

需要另外測定，建議使用本公司BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。

（2） 按樣本鮮重計算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 丙酮酸定義為一個酶活力單位。

GOT（nmol/min/g 鮮重）=[（ΔA+0.0013）÷0.2384×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×10³ =209.7×（ΔA+0.0013）÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 丙酮酸定義為一個酶活力單位。

GOT（nmol/min/10⁴ cell）= [（ΔA+0.0013）÷0.2384×V1]÷(500×V1÷V2)÷T×10³ =0.419×（ΔA+0.0013）

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.01ml；V2：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時間，20 min；Cpr：

蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬；10³：1umol/ml=10³ nmol/ml。 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為：0.01 umol/ml -2 umol/ml。

2、ΔA 線性范圍為：0.01 -1。

亮an酸氨基肽酶試劑盒 氨基酸系列-常備現(xiàn)貨