huang嘌呤氧化酶（xanthione oxidase, XOD）試劑盒說明書

微量法 100 管/96 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

XOD（EC 1.17.3.2）催化huang嘌呤氧化生成尿酸和超氧陰離子，是活性氧主要來源之一；同時(shí)也是核苷酸代謝的關(guān)鍵酶之一。XOD 主要分布于哺乳動(dòng)物的心，肺，肝臟等組織中，當(dāng)肝功能受損時(shí)，XOD 大量釋放到血清中，對(duì)肝損害的診斷具有特異性的意義。

測(cè)定原理：

XOD 催化huang嘌呤產(chǎn)生尿酸，尿酸在 290nm 下有特征吸收峰。

huang嘌呤氧化酶試劑盒   氧化系列

試劑組成和配制

需自備儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板（UV 板）、研缽、冰和蒸餾水。

粗酶液提取：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 290nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 XOD 檢測(cè)工作液的配制：用時(shí)在每瓶試劑二中加入 15ml 試劑一，充分混勻，待用；現(xiàn)配現(xiàn)用；

3、 測(cè)定前將XOD 檢測(cè)工作液在 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴 10min 以上。

4、 準(zhǔn)備 96 孔UV 板一塊（非普通酶標(biāo)板，普通酶標(biāo)板只能透過可見光，不能透過紫外光，檢測(cè)波長(zhǎng)小于 340nm 務(wù)必使用UV 板）。

5、在微量石英比色皿或 96 孔UV 板中加入 10μl 樣本和 250μl 工作液，立即混勻并計(jì)時(shí)，記錄 290nm下初始吸光值A1 和 1min 后的吸光值 A2。計(jì)算ΔA＝A2-A1。

XOD 活性計(jì)算：

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清（漿）XOD 計(jì)算：

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 尿酸定義為一個(gè)酶活力單位。

XOD（nmol/min/ml）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷V 樣÷T=2131×ΔA 2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中XOD 計(jì)算：

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 尿酸定義為一個(gè)酶活力單位。

XOD（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr)÷T =2131×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 尿酸定義為一個(gè)酶活力單位。

XOD（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W ×V 樣÷V 樣總）÷T=2131×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每一萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 尿酸定義為一個(gè)酶活力單位。

XOD（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V 樣÷V 樣總）÷T=4.26×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2.6×10^-4 L；ε：尿酸摩爾消光系數(shù)，1.22×10⁴ L/ mol /cm；d：比色皿光徑， 1cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；W：樣本 質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬。

b. 用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下的回歸曲線為y = 1.2396x + 0.0259，R² = 0.9977；其中 y 為△A，x 為NADPH 濃度nmol/ml 1、血清（漿）中NADPH 含量計(jì)算

NADPH 含量(nmol/ml）= [(△A -0.0259）÷1.2396×V1)] ÷(V3×V1÷V2)= 16.1× (△A -0.0259）

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中NADPH 含量計(jì)算

(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算

NADPH (nmol/mg prot）=[ (△A -0.0259）÷1.2396×V1)] ÷(V1×Cpr)= 0.8× (△A -0.0259）÷Cpr

(2) 按樣本鮮重計(jì)算

NADPH (nmol/g 鮮重）=[(△A -0.0259）÷1.2396×V1) ]÷(W×V1÷V2)=1.6× (△A -0.0259）÷W

(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

NADPH (nmol/10⁴ cell）=[(△A -0.0259）÷1.2396×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.003× (△A -0.0259）

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.05ml；V2：加入提取液體積，2ml；V3：加入血清（漿）體積：0.1ml； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬。

huang嘌呤氧化酶試劑盒   氧化系列