生物催化劑在能源、材料和醫(yī)藥領(lǐng)域具有重要應(yīng)用，如何高效、精準(zhǔn)地設(shè)計(jì)并篩選出具有特定功能的生物催化劑一直是研究熱點(diǎn)。然而，當(dāng)前酶的定向進(jìn)化方法存在很多局限性，設(shè)計(jì)與篩選過(guò)程往往耗時(shí)費(fèi)力，且受限于生物體內(nèi)復(fù)雜的遺傳與環(huán)境因素。因此，開(kāi)發(fā)一種高效、靈活且可控的生物催化劑設(shè)計(jì)與篩選平臺(tái)顯得尤為重要。
今天，小編將和您分享一篇今年發(fā)表于《Nature Communications》上的文獻(xiàn)“Accelerated enzyme engineering by machine-learning guided cell-free expression"，該文獻(xiàn)介紹了一種全新的高通量方法，用于探索化學(xué)空間多個(gè)區(qū)域的適應(yīng)度景觀，以實(shí)現(xiàn)生物催化劑的前瞻性設(shè)計(jì)。（注：適應(yīng)度景觀是一種理論模型，它將每個(gè)可能的蛋白質(zhì)序列映射到一個(gè)適應(yīng)度值上。適應(yīng)度可以理解為該蛋白質(zhì)在特定環(huán)境下的功能表現(xiàn)或生存優(yōu)勢(shì)。）
一、研究背景
酶工程旨在通過(guò)改造蛋白質(zhì)序列來(lái)增強(qiáng)天然功能或賦予新功能，傳統(tǒng)定向進(jìn)化方法通過(guò)反復(fù)突變與篩選優(yōu)化酶性能，但存在顯著瓶頸：
1.序列空間探索受限，低通量篩選難以覆蓋序列空間，可能遺漏關(guān)鍵協(xié)同突變；
2.多目標(biāo)優(yōu)化困難，單一酶需適配多種底物或反應(yīng)（如合成不同藥物分子），但現(xiàn)有方法難以并行優(yōu)化多個(gè)功能目標(biāo)；
3.數(shù)據(jù)生成效率低，構(gòu)建高質(zhì)量序列-功能數(shù)據(jù)集需合成并測(cè)試海量突變體，傳統(tǒng)方法依賴(lài)于體內(nèi)表達(dá)系統(tǒng)，但這一過(guò)程受到細(xì)胞生長(zhǎng)周期、穩(wěn)態(tài)條件及生產(chǎn)適應(yīng)性等多重因素的制約，導(dǎo)致篩選效率低下且成本高昂。
盡管機(jī)器學(xué)習(xí)為酶設(shè)計(jì)提供了新思路，但如何高效構(gòu)建大規(guī)模序列-功能數(shù)據(jù)集仍是核心挑戰(zhàn)。為了應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)，研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一個(gè)集成無(wú)細(xì)胞DNA組裝、無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)和蛋白功能分析的平臺(tái)，能夠快速生成新的適用性蛋白序列并快速驗(yàn)證這些新蛋白序列的實(shí)際功能，并優(yōu)化多種不同化學(xué)反應(yīng)的酶。
圖1:機(jī)器學(xué)習(xí)指導(dǎo)的無(wú)細(xì)胞酶工程平臺(tái)
二、無(wú)細(xì)胞表達(dá)技術(shù)的突破性作用
無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)作為一種新興的生物技術(shù)平臺(tái)，為生物催化劑的設(shè)計(jì)與篩選提供了新的解決方案。該系統(tǒng)能夠在體外環(huán)境中快速合成并測(cè)試蛋白質(zhì)，不受細(xì)胞生長(zhǎng)周期及穩(wěn)態(tài)條件的限制，因此具有更高的靈活性和可控性。在本篇文獻(xiàn)中，研究團(tuán)隊(duì)利用無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)算法，構(gòu)建了一個(gè)高通量的生物催化劑設(shè)計(jì)與篩選平臺(tái)。該平臺(tái)能夠在短時(shí)間內(nèi)合成并測(cè)試大量具有不同序列的蛋白質(zhì)，并通過(guò)機(jī)器學(xué)習(xí)算法預(yù)測(cè)并篩選出具有催化性能的候選者。這一方法不僅顯著提高了篩選效率，還降低了成本，為生物催化劑的前瞻性設(shè)計(jì)提供了有力支持。
具體來(lái)說(shuō)，本研究通過(guò)以下創(chuàng)新解決了現(xiàn)有酶工程的技術(shù)難點(diǎn)：
1. 高通量無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)
利用無(wú)細(xì)胞DNA組裝與表達(dá)，用于構(gòu)建定點(diǎn)飽和、序列明確的蛋白質(zhì)庫(kù)。工作流程包括五個(gè)步驟：通過(guò)PCR引入突變、DpnI消化親本質(zhì)粒、 Gibson組裝形成突變質(zhì)粒、第二次PCR擴(kuò)增線性DNA表達(dá)模板（LETs）、通過(guò)CFE（無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)）表達(dá)突變蛋白。該方法可在一天內(nèi)構(gòu)建數(shù)百到數(shù)千個(gè)序列明確的蛋白質(zhì)突變體，并可通過(guò)快速迭代積累突變。此外，使用單體超穩(wěn)定綠色熒光蛋白（muGFP）驗(yàn)證了該工作流程，針對(duì)四個(gè)已知對(duì)穩(wěn)定性和熒光重要的殘基進(jìn)行突變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法對(duì)引物設(shè)計(jì)偏差具有高容忍度，并且所有預(yù)期突變均成功引入。
2. 機(jī)器學(xué)習(xí)模型加速設(shè)計(jì)
基于單突變數(shù)據(jù)訓(xùn)練增強(qiáng)嶺回歸模型，并使用歸一化折損累積增益（NDCG）評(píng)估模型預(yù)測(cè)性能，結(jié)合進(jìn)化與物理化學(xué)特征編碼，成功預(yù)測(cè)多突變組合的活性。模型從80個(gè)單突變數(shù)據(jù)中推斷高階突變，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證顯示預(yù)測(cè)變體的活性提升達(dá)1.6-42倍（如抗抑郁藥莫氯貝胺的轉(zhuǎn)化率從12%提升至96%）。
圖2:工作流程示意圖
3. 并行優(yōu)化多反應(yīng)目標(biāo)
研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一個(gè)能夠加速生物催化反應(yīng)并顯著減少篩選的工作量的并行優(yōu)化流程，他們選擇了具有底物普適性的酶McbA作為研究對(duì)象，通過(guò)并行處理多個(gè)反應(yīng)，同時(shí)測(cè)試不同的突變體，從而快速識(shí)別出具有更高催化活性的突變體。為了進(jìn)一步提高篩選效率，研究者們采用了機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)來(lái)預(yù)測(cè)突變體的催化活性。通過(guò)訓(xùn)練模型，根據(jù)突變體的序列信息預(yù)測(cè)其催化活性。并且能夠在實(shí)驗(yàn)前對(duì)突變體進(jìn)行初步篩選，從而減少了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的工作量。相比于ISM（iterative saturation mutagenesis）單獨(dú)使用，此框架顯著加快了工程進(jìn)度，可在一周內(nèi)同時(shí)完成六種酶的改造任務(wù)，突變體的產(chǎn)量提高了1.6到34倍。另外，該方法成本低廉（每10微升反應(yīng)僅需幾分錢(qián)）且具有高可擴(kuò)展性。
圖3:用于McbA機(jī)器學(xué)習(xí)引導(dǎo)的蛋白質(zhì)工程策略
總結(jié)與展望
本研究將無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)的高通量?jī)?yōu)勢(shì)與機(jī)器學(xué)習(xí)的預(yù)測(cè)能力結(jié)合，用于生物催化劑的前瞻性設(shè)計(jì)。實(shí)現(xiàn)酶工程從單目標(biāo)到多任務(wù)的跨越式發(fā)展，為可持續(xù)生物制造注入新動(dòng)力。不僅突破了傳統(tǒng)酶工程的效率瓶頸，使其同時(shí)具備速度與通量、精準(zhǔn)預(yù)測(cè)能力等，還顯著提高了生物催化劑的設(shè)計(jì)與篩選效率，為綠色化學(xué)與定制化生物催化劑開(kāi)發(fā)提供了全新范式。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步和創(chuàng)新，無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)有望為生物技術(shù)領(lǐng)域帶來(lái)更多機(jī)遇和挑戰(zhàn)。
參考文獻(xiàn)：Landwehr, G.M. et al. Accelerated enzyme engineering by machine-learning guided cell-free expression. *Nat. Commun.* **16**, 865 (2025).
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