八聚體錐形孔跨膜蛋白——MspA蛋白
恥垢分枝桿菌毒素蛋白（Mycobacterium smegmatisporin A, MspA）是一種通道形成蛋白，用于小分子和水的通道。MspA是分子量 20 kDa 的單體蛋白構(gòu)建的同源性八聚體，其形狀為“八"字形杯狀結(jié)構(gòu)。MspA長(zhǎng)度大約 1 nm，具有大約1 nm的寬度收縮區(qū)，兩側(cè)有明顯較大的直徑區(qū)域。
MspA 擁有很好的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，在 100℃的溫度下活性能耐受 30 min，在80℃的2% SDS條件中培養(yǎng)15分鐘依然可以保持良好的通道活性，在 pH 0~14 的范圍內(nèi)保持穩(wěn)定，同時(shí)MspA具有易于進(jìn)行多位點(diǎn)突變修飾。
圖1 MspA突變體的結(jié)構(gòu)與表達(dá)
MspA是一種納米孔分析的理想材料
MspA 的幾何形狀可以提供很好的空間分辨率，因?yàn)殡x子電流阻塞的特征主要是由穿過(guò)孔隙狹窄區(qū)域的多核苷酸片段決定的。另外，MspA 擁有很好的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，最后，MspA可以為多種氨基酸替代保留高水平表達(dá)和通道活性，是一種通過(guò)定點(diǎn)誘變進(jìn)行工程設(shè)計(jì)的理想選擇。近年來(lái)，MspA蛋白在單分子檢測(cè)領(lǐng)域的研究和應(yīng)用得到越來(lái)越多關(guān)注，MspA蛋白納米孔最重要的應(yīng)用集中在DNA測(cè)序方面，主要用于檢測(cè)表征ssDNA。
圖2 納米孔測(cè)序原理
MspA在生物和醫(yī)學(xué)展現(xiàn)應(yīng)用潛力
MspA作為一種具有錐形結(jié)構(gòu)的八聚體孔道蛋白，通過(guò)引入突變開發(fā)工程化MspA孔道，可以實(shí)現(xiàn)多種單糖直接區(qū)分，說(shuō)明MspA是核酸與多種生物大分子檢測(cè)的有力品。
MspA是細(xì)菌細(xì)胞外膜上親水性營(yíng)養(yǎng)溶質(zhì)的主要通道，負(fù)電性密集的收縮區(qū)具有天冬氨酸的雙圈結(jié)構(gòu)，能夠與陽(yáng)離子結(jié)合。使用合適的通道阻斷劑可以堵塞MspA蛋白孔，則親水性營(yíng)養(yǎng)溶質(zhì)不能輸送進(jìn)細(xì)菌體內(nèi)，造成細(xì)菌休眠，同時(shí)可以破壞細(xì)胞外壁的穩(wěn)定性，增強(qiáng)細(xì)菌的抗生素易感性，對(duì)于疾病治療具有重要作用。
圖3 MspA實(shí)現(xiàn)單糖區(qū)分
珀羅汀基于無(wú)細(xì)胞體系成功表達(dá)MspA八聚體跨膜蛋白
客戶案例
收到MspA序列后，珀羅汀構(gòu)建融合了GFP的線性化表達(dá)模版，隨后，采用自主研發(fā)的PLD無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)試劑盒（膜蛋白（或困難蛋白）表達(dá)增強(qiáng)版，#PLDK002）進(jìn)行蛋白合成，蛋白合成后采用9種方案進(jìn)行合適的表面活性劑篩選，對(duì)于目的蛋白的表達(dá)結(jié)果采用SDS-PAGE進(jìn)行鑒定。
圖4 目的蛋白表達(dá)鑒定
（channel 1：空白對(duì)照；channel 2~10：不同方案的目的膜蛋白表達(dá)情況；channel 11：marker）
之后，選擇PLDK002-C（channel 3）和PLDK002-I（channel 9） 的無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)體系進(jìn)行第二輪優(yōu)化。優(yōu)化結(jié)果顯示，channel 5的無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)方案可以正確表達(dá)該MspA的單體與多聚體。
圖5 MspA目的蛋白表達(dá)鑒定
客戶評(píng)價(jià)
這次選擇比較新穎的無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)體系進(jìn)行MspA表達(dá)，珀羅汀僅用4天完成小試，相當(dāng)快速，膠圖結(jié)果中單體和多聚體的亞基都是對(duì)的。相比于細(xì)胞表達(dá)體系，無(wú)細(xì)胞體系可以輕松實(shí)現(xiàn)多亞基膜蛋白表達(dá)及正確組裝的難題。對(duì)于復(fù)雜多亞基超結(jié)構(gòu)膜蛋白的結(jié)構(gòu)研究和物理、化學(xué)、生物性質(zhì)研究而言，這無(wú)疑是巨大的福音。
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Tom Z, Mikhail P,et al.Single-molecule DNA detection with an engineered MspA protein nanopore. PNAS,doi 10.1073 (2008).
SY Zhang,ZY Cao,et al.A Nanopore-Based Saccharide Sensor. Angew.Chem. Int.Ed.doi.org/10.1002/anie.202203769 (2022).
Ayomi S. Perera,et al. Channel Blocking of MspA Revisited. Langmuir.doi.org/10.1021/la3037296 (2012).
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