產(chǎn)品類型和操作步驟:
ELISA可用于測定抗原,也可用于測定抗體。在這種測定方法中有3種必要的試劑:
1.固相的抗原或抗體,
2.酶標(biāo)記的抗原或抗體,
3.酶作用的底物。根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的性狀以及檢測的具備條件,可設(shè)計出各種不同類型的檢測方法。
(一)雙抗體夾心法、
(二)一步法、
(三)間接法測抗體、
(四)競爭法。
試劑配制:
1、酶聯(lián)板(Assay plate ):一塊(96孔或者48孔)。
2、標(biāo)準(zhǔn)品(Standard):2瓶(凍干品)。
3、樣品稀釋液(Sample Diluent):1×20ml/瓶。
4、生物素標(biāo)記抗體稀釋液(Biotin-antibody Diluent):1×10ml/瓶。
5、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 (HRP-avidin Diluent):1×10ml/瓶。
6、生物素標(biāo)記抗體(Biotin-antibody):1×120μl/瓶(1:100)
7、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素(HRP-avidin):1×120μl/瓶(1:100)
8、底物溶液(TMB Substrate):1×10ml/瓶。
9、濃洗滌液(Wash Buffer):1×20ml/瓶,使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10、終止液(Stop Solution):1×10ml/瓶(2N H2SO4)。
產(chǎn)品選型：
1是檢測抗體還是抗原。
2:檢測的結(jié)果是定性還是定量。
3是否需要檢測特異抗體的類型。
4:所用抗體/單克隆抗體的親和力/親和力怎么樣
操作步驟：
1.標(biāo)準(zhǔn)品的加樣 :設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL;o
2.加樣: 分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同)、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μ l,然后再加待測樣品10μ1(樣品最終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
3.加酶: 每孔加入酶標(biāo)試劑100μ1,空白孔除外。
4.溫育: 用封板膜封板后置37C溫育60分鐘。
5. 配液:將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。
6.洗滌: 小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次,拍干。
7. 顯色:每孔先加入顯色劑A50μ1,再加入顯色劑B50μ1,輕輕震蕩混勻，37C避光顯色15分鐘。
8. 終止:每孔加終止液50μ1,終止反應(yīng)(此時藍色立轉(zhuǎn)黃色)。
9.測定:以空白孔調(diào)零, 450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。
標(biāo)準(zhǔn)曲線計算:
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，0D 值為縱坐標(biāo),在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)樣品的0D值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度;再乘以稀釋倍數(shù);或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與0D值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的0D值代入方程式，計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。