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1.原理：免疫分析是一種利用特定抗體與抗原或半抗原發(fā)生的高選擇性高特異性識(shí)別和結(jié)合原理，對(duì)待測(cè)抗體或者抗原進(jìn)行分析測(cè)定的方法，酶聯(lián)免疫吸附分析（下稱ELISA）是免疫分析的一種，分三個(gè)部分組成：免疫識(shí)別，信號(hào)輸出和數(shù)據(jù)處理。

2.步驟：免疫識(shí)別是在聚苯乙烯制成的96孔板上包被抗體，而后利用抗體識(shí)別待測(cè)的抗原（通常是疾病的蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物，病毒，細(xì)菌等等，從復(fù)雜待測(cè)液中將抗原吸附到96孔板表面。接著用帶有辣根過(guò)氧化酶（Horseradish Peroxidase, HRP）、熒光或放射性標(biāo)記的抗體通過(guò)直接或者間接的方式輸出識(shí)別信號(hào)。后利用信號(hào)強(qiáng)度，標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度梯度等信息計(jì)算得出待測(cè)樣中目標(biāo)抗原的濃度。

3.分類：根據(jù)免疫識(shí)別和信號(hào)輸出方式的不同，ELISA可以分為雙抗體夾心法、直接免疫競(jìng)爭(zhēng)法和非直接免疫競(jìng)爭(zhēng)法等等。其中雙抗體夾心法在商業(yè)應(yīng)用上常見(jiàn)。

大鼠骨粘連蛋白(ON)ELISA試劑盒注意事項(xiàng)：

1.所有的操作過(guò)程一般都用排槍處理，在操作過(guò)程中，排槍吸兩檔打一檔，會(huì)防止氣泡的產(chǎn)生，并且操作時(shí)一定要保證槍頭每步都要插緊，選擇配套的槍頭尤為重要，槍頭容易掉，影響實(shí)驗(yàn)效果，此外每一步都要看好槍頭的頁(yè)面要平齊，避免槍頭松動(dòng)自己卻不知。

2.在處理稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的過(guò)程中，要在渦旋儀上點(diǎn)一下，使混勻，但振蕩過(guò)程不宜過(guò)長(zhǎng)，防止出現(xiàn)蛋白質(zhì)降解變性的現(xiàn)象

3.二抗的稀釋濃度對(duì)顯色效果起著至關(guān)重要的作用，每次選用新的二抗或在-80度冰箱拿分裝好的二抗是每一次都做一個(gè)預(yù)實(shí)驗(yàn)，設(shè)置不同的二抗?jié)舛群惋@色時(shí)間，從而確定相應(yīng)的條件，方可做好大規(guī)模的篩選細(xì)胞工作。

4.同種細(xì)胞株的ELISA孵育時(shí)間要保持一致，降低無(wú)關(guān)變量的影響。

5.各種抗體的保存是在-80度冰箱，一定要將降低凍融次數(shù)，蛋白比較敏感，凍融次數(shù)多，蛋白活性就會(huì)降低。

6.稀釋樣品時(shí)一定要保證混勻，槍尖在液面以下吹打相同的次數(shù)，可防止出現(xiàn)氣泡。

7.分析數(shù)據(jù)的過(guò)程中，一般至少要5個(gè)點(diǎn)，不然數(shù)據(jù)沒(méi)有相應(yīng)的說(shuō)服力。

8.96孔板取完樣品后，蓋好，提早加好DPBS稀釋液，防止時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，樣品揮發(fā)，濃度不準(zhǔn)。
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