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上期我們簡單介紹了一下動物細胞核懸液制備試劑盒，這期我們詳細介紹一下具體使用步驟吧。

一、材料

1.組織處理工具:手術剪、手術刀、鑷子等

2.儀器:水平離心機、組織研磨儀、細胞計數(shù)儀。

3.試劑:RNase 抑制劑、BSA.

4.耗材:含有鋯珠的研管、低吸附槍頭、5mL和15mL離心管、40μm(和10μm)細胞篩.

二、動物細胞核懸液制備試劑盒使用方法

準備工作:

1、切取組織約 200mg(黃豆粒大小)

2、裂解液、前懸液和后懸液需要添加 BSA，終濃度 1%，根據(jù)樣本所需試劑體積現(xiàn)用現(xiàn)配。細胞核 RNA 相關實驗，實驗過程中所有試劑都需要加RNase抑制劑(終濃度1U/L)，根據(jù)樣本所需試劑體積現(xiàn)用現(xiàn)配。如:每1mL溶液需要加40 U/uL的RNase 抑制劑25 μL.

三、動物細胞核懸液制備試劑盒操作步驟:

1.使用移液器吸取1mL 裂解液，緩慢注入含有鋯珠的研磨管中

2.迅速將細胞樣本、新鮮組織或冰凍組織樣本轉移至上述裝有裂解液和鋯珠的研磨管內勇盡可能使組織塊細小均勻，如圖2

3.使用組織研磨儀研磨至無明顯組織大塊，使組織呈均勻的勻漿狀，如圖3.將研磨好的樣本靜置2~3min(時間不要超過3min)，將樣本緩慢倒入40um 細胞篩中進行過濾，使用15m離心管收集濾液5.使用1~3mL前懸液沖洗研磨管和細胞篩，確保殘留在其中的細胞和組織碎片被充分沖洗下來，并將沖洗液一并收集到第4步裝有濾液的15m離心管中。

6.使用水平離心機，4℃，500xg，離心5min，棄上清.

7.使用前懸液重懸沉淀至300L，加入等體積(300μ)的PB1，用移液器吹打混勻。將混合后的600液轉移至一新的5m離心管中。8.吸取 600LPB2,將槍頭緩慢插人離心管最底層，輕柔緩慢加入PB2,使溶液自然分層,避免擾動下層溶液

9.吸取600μLPB3,將槍頭緩慢插到離心管最底層，輕柔緩慢加人PB3，使溶液再次分層操作過程中要保持手部穩(wěn)定，控制加入液體的速度，如圖4.

10.務必使用水平離心機，并設置為居中的加速度和減速度，4°C，3000xg，離心20 min.11.離心后，緩慢取出離心管。溶液分成3層。核層位于PB2和PB3溶液交界處，移除上方碎片層(約1000L)，去除碎片層后吸取核層(約400L液體)于新的離心管中，如圖4 和圖 5.

12.加人5倍體積(約2mL)的后懸液，吹打混勻。

13.使用水平離心機，4℃，700xg離心5min，棄上清

14.根據(jù)所需的細胞核濃度，使用約50~2mL的后懸液將沉淀重懸。若需要較高的細胞核濃度，可選擇較小體積的后懸液;若需要較低濃度，則選擇較大體積的后懸液15.觀察計數(shù)儀明場，若存在大于細胞核的碎片且細胞核量足夠,可在保持細胞核懸液較高濃度的情況下，再經(jīng)10μm 細胞篩去除雜質。若背景干凈，無明顯雜質，則可跳過此步驟16.質控結束后應立即進行后續(xù)相關實驗。