PCR實驗中產(chǎn)生的嵌合體你知道是什么呢？它怎么產(chǎn)生的呢？那又如何預(yù)防和處理呢？這篇文章讓我們一起了解一下吧！
一、PCR嵌合體是什么
PCR嵌合體(Chimeric Products)：PCR擴增反應(yīng)中的嵌合體是指一個PCR產(chǎn)物來自兩個或多個模板分子，通常是由于延伸未完quan導(dǎo)致的?。這種現(xiàn)象通常發(fā)生在PCR反應(yīng)中，特別是當使用多重PCR或復(fù)雜模板時。嵌合體會導(dǎo)致擴增產(chǎn)物中含有非預(yù)期的片段，有可能會影響實驗結(jié)果的準確性，甚至導(dǎo)致錯誤的解釋。
二、形成原理
在PCR反應(yīng)中，DNA模板在高溫下解旋成單鏈，然后在低溫下引物與單鏈按堿基互補配對的原則結(jié)合。當DNA聚合酶在延伸階段未能wanquan復(fù)制某個序列時，該部分序列在下一輪PCR反應(yīng)中作為引物繼續(xù)延伸，從而與其他序列混合，形成嵌合體序列?。具體來說，DNA聚合酶在擴增某一片段時，可能會在模板鏈的某個位置發(fā)生“跳躍"，將一個模板DNA片段與另一個模板片段拼接，從而生成嵌合體產(chǎn)物。嵌合體可以通過多種機制形成，但大多數(shù)嵌合體被認為是由于擴增不完整而引起的
常見的情況有以下三種：
模板DNA之間的重組
在PCR中，如果存在多個不同的模板DNA，它們的片段可能在擴增過程中偶然地組合在一起。具
引物二聚體和擴增錯誤
引物二聚體是引物分子自我結(jié)合形成的二聚體。如果PCR引物設(shè)計不當，或者引物濃度過高，可能會導(dǎo)致引物二聚體的產(chǎn)生，這些二聚體可能會參與擴增過程，導(dǎo)致非特異性的擴增。在某些情況下，DNA聚合酶在復(fù)制錯誤的引物二聚體或非特異性產(chǎn)物時，也可能會形成嵌合體。
DNA聚合酶的"跳躍"現(xiàn)象
DNA聚合酶在延伸過程中，有時會發(fā)生“跳躍"或“滑移"，從一個模板區(qū)域轉(zhuǎn)移到另一個模板區(qū)域，這種現(xiàn)象通常發(fā)生在復(fù)雜的、含有重復(fù)序列或相似序列的區(qū)域。例如，如果模板中存在相似的序列(常見的擴增子測序)，聚合酶可能會錯誤地“切換"到另一條模板鏈，導(dǎo)致不同片段的連接，從而產(chǎn)生嵌合體。
總結(jié)：
通常在PCR過程中，大概有1%的幾率會出現(xiàn)嵌合體序列，而以在16S/18S/ITS 擴增子測序的分析中，系統(tǒng)相似度很高，當擴增相似序列時，嵌合體可達1%-20%，需要去除嵌合體序列。
嵌合體的比例與PCR循環(huán)數(shù)相關(guān)，循環(huán)數(shù)越高，嵌合體比例越高。
使用純凈、單一來源的模板，避免多重模板
優(yōu)化引物設(shè)計，確保引物特異性，避免引物二聚體產(chǎn)生
降低PCR反應(yīng)溫度和優(yōu)化擴增條件
減少PCR循環(huán)次數(shù)
使用高保真(High-Fidelity)DNA聚合酶
使用有限的DNA模版量
怎么判斷你的PCR產(chǎn)物中有沒有嵌合體呢？可以使用以下方法進行檢測：
凝膠電泳：通過凝膠電泳查看PCR產(chǎn)物的大小和模式，若出現(xiàn)多個不一致的條帶或意外的遷移模式，可能意味著嵌合體的存在。
測序：對PCR產(chǎn)物進行DNA測序。通過對比測序結(jié)果與預(yù)期的目標序列，可以檢測到嵌合體的存在，并分析嵌合體的組成。
限制性酶切分析：如果知道嵌合體的可能位置，可以使用限制性內(nèi)切酶切割PCR產(chǎn)物，分析切割結(jié)果是否符合預(yù)期。（如需凝膠電泳產(chǎn)品，NEB PaqCI限制性內(nèi)切酶、測序試劑盒，請聯(lián)系天津益元利康生物科技有限公司）
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