細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法之一。利用凍存技術(shù)將細(xì)胞置于-196℃液氮中低溫保存，可以使細(xì)胞暫時脫離生長狀態(tài)而將其細(xì)胞特性保存起來，這樣在需要的時候再復(fù)蘇細(xì)胞用于實驗。既可以防止因正在培養(yǎng)的細(xì)胞被污染或其他意外事件而使細(xì)胞丟種，又起到了細(xì)胞保種的作用。那么你知道細(xì)胞凍存的操作步驟是什么嗎？讓我們一起來看看吧！
實驗開始前，要先做好準(zhǔn)備工作：
將凍存管、離心管、移液管、移液器等耗材準(zhǔn)備齊全，放入超凈臺中，打開紫外線照射 30 分鐘。打開通風(fēng)機通風(fēng) 3 分鐘。用 75%酒精擦拭操作臺和雙手。準(zhǔn)備好冰盒。將離心機調(diào)節(jié)至所需轉(zhuǎn)速，細(xì)胞完全培養(yǎng)基、DMSO、胰酶等放于37℃水浴箱中預(yù)熱。
凍存步驟：
1. 取出細(xì)胞，酒精消毒，放入超凈臺。
Tip1：應(yīng)在細(xì)胞生長良好、致密度約為 80-90%，活力達(dá) 90%以上的狀態(tài)下凍存。細(xì)胞活力差的細(xì)胞在凍存后的成活率很小，因此，一定要在細(xì)胞旺盛分裂時期凍存。
2. 配置細(xì)胞凍存液：按無血清培養(yǎng)基：血清：DMSO=7:2:1 的比例配置細(xì)胞凍存液?！净蛘哐澹篋MSO=9：1，亦可以根據(jù)細(xì)胞特性，選擇供應(yīng)商推薦的凍存液配方】。
Tip2：DMSO 應(yīng)為試劑級等級，無菌且無色，可以用0.22微米濾膜過濾，或者直接購買無菌產(chǎn)品。以5-10 ml小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍。
Tip3：因DMSO本身就有滅菌的作用，因此使用前不需要進行高壓滅菌。高壓滅菌反而會破壞它的分子結(jié)構(gòu)，以至于降低冷凍保存效果。
Tip4：在常溫下，DMSO對人體有害，應(yīng)注意生物安全防護。
Tip5：凍存液應(yīng)該提前配制，防止臨時配制產(chǎn)生的熱量損傷細(xì)胞。
Tip6：加大凍存液中血清的比例對于保存某些脆弱的干細(xì)胞以及一些比較珍貴的細(xì)胞很有好處的。
3. 按照細(xì)胞傳代步驟，對細(xì)胞進行消化、解離。
4. 消化好的細(xì)胞離心后，棄掉上清液，用凍存液重懸。
Tip7：用移液器吸去上清液時，不要吸到底部的細(xì)胞沉淀。
Tip8：用移液器輕柔吹打細(xì)胞，避免損傷細(xì)胞。
Tip9：混勻 DMSO 要快，因為 DMSO 對細(xì)胞有毒性，混合后應(yīng)盡快凍存。
5. 可用細(xì)胞計數(shù)板或計數(shù)儀器對細(xì)胞進行計數(shù)，將細(xì)胞總數(shù)調(diào)節(jié)至細(xì)胞數(shù)量為5×105/ml為宜。
6. 將細(xì)胞凍存懸液分裝入細(xì)胞凍存管中，一般2ml凍存管裝入 1 -1.5 ml細(xì)胞凍存懸液為宜。
7. 放入專業(yè)的細(xì)胞凍存盒中，或者按照：
﹣4 ℃ 30分鐘→20℃ 30分鐘→﹣80℃過夜→液氮保存的順序進行凍存。
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