RNA 是一種核酸分子，在生物學(xué)中扮演著重要的角色。在細(xì)胞內(nèi)，RNA 不僅具有轉(zhuǎn)錄和翻譯的功能，而且在調(diào)控基因表達(dá)、細(xì)胞信號傳導(dǎo)以及病理機(jī)制等方面也發(fā)揮著重要的作用。Trizol法是目前普遍使用的RNA提取方法，那么Trizol法提取RNA的原理與步驟是什么？讓我們一起來看看吧！
一、Trizol法的實(shí)驗(yàn)原理
TRIZOL 試劑是直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA的試劑，它在破碎和溶解細(xì)胞時能保持 RNA 的完整性。試劑主要成分為異硫氰酸和苯酚，其中異硫氰酸肌可裂解細(xì)胞，促使核蛋白體的解離，使 RNA 與蛋白質(zhì)分離，并將 RNA 釋放到濟(jì)液中。加入氯仿后離心，樣品分成水樣層(無色)和有機(jī)層(黃色)。RNA 存在于水樣層中。收集上面的水樣層后，RNA 可以通過異丙醇沉淀來還原。在除去水樣層后，樣品中的 DNA 和蛋白也能相繼以沉淀的方式還原。乙醇沉淀能析出中間層的 DNA，在有機(jī)層中加入異丙醇能沉淀出蛋白。
二、Trizol法提取RNA操作步驟
1. 勻漿并裂解樣本
組織樣本：每10~100mg組織加入1ml TRNsol，建議使用機(jī)械勻漿器來勻漿。另外也可 用液氮來破碎組織，用研缽、研杵把組織粉碎后，把粉末轉(zhuǎn)移至一干凈的1.5ml小離心管中，在15- 30°C放置5分鐘，以che底分離核蛋白復(fù)合體。。樣本的體積應(yīng)不超過所使用的TRNsol的體積的10%，否則會出現(xiàn)DNA污染。
2. 相分離
每1 ml TRNsol中加0.2 ml 氯仿。蓋上離心管蓋子，劇烈地振蕩15sec，在冰上孵育5 min。室溫 下，12,000×g下離心10min。此時混合物分成三層：底層為苯酚氯仿相層（紅色），中間層，和上層水相層（無色）。水相占總TRIZOL的60%，RNAwan全存在于水相中。
3. RNA沉淀
轉(zhuǎn)移不多于80%上層水相至新的離心管中，往水相中加入異丙醇，每使用1ml的TRNsol，加入 500μl的異丙醇(注：如果是含多糖、多酚的植物樣品，請加入300μl異丙醇的同時加入300μl 0.8M 檸檬酸鈉/1.2M NaCl混合液)。渦旋混勻，室溫下放置10min，然后在4度下12,000×g離心10min，離心前可以在管的側(cè)壁和底部看到絮狀膠樣沉淀，這就是RNA沉淀。糖類豐富的樣本：富含多糖的植物樣本或富含糖胺聚糖和蛋白質(zhì)聚糖的動物樣本需要使用以下的 修飾的沉淀方法來獲得純的RNA。準(zhǔn)備1份Buffer A（1.2M NaCl，0.8M檸檬酸鈉）。做完第二步后， 緊接著依次往水相中加入異丙醇和Buffer A （1ml TRNsol加0.3ml的異丙醇和0.3ml的Buffer A）。旋渦混勻，并在室溫下,≤12,000×g離心10min，這一高鹽沉淀會減少復(fù)雜糖類的共同純化。
4. RNA洗滌
洗滌RNA:棄上清， 并用75%乙醇洗滌沉淀一次。旋渦混和樣本，并在室溫下以不超過7,500×g 的速度離心樣本5min。注意：75％的乙醇必須用DEPC處理過的滅菌水來配制，否則75％乙醇中 殘留的RNaseA會降解RNA。5. RNA的溶解:小心地吸棄乙醇，短暫離心將溶滴甩到管底，用移液槍小心吸棄殘留的溶液。室 溫下空氣干燥RNA 5-10min。不要用離心干燥裝置或真空干燥裝置，因?yàn)檫^度干燥會導(dǎo)致很難用 水重新溶解RNA。加入適當(dāng)?shù)?/span>DEPC水溶解RNA。
5. RNA再溶解
去上清，置真空或空氣中5-10分鐘，干燥RNA沉淀，（不能在真空中離心干燥）。注意不能將RNA沉淀wan全干燥，這樣會極大地降低它的溶解度。部份溶解的RNA樣品其A260/280 ratio < 1.6。
用無RNase 水或0.5% SDS溶液重懸RNA沉淀，用槍頭反復(fù)吹打幾次，靜置10分鐘，55-60°C。測濃度后-20°C保存。
6. 測濃度
取2μl 儲存液加入另一個EP管中，再加入98μl無RNase水，離心混勻，以無RNase水作空白對照，測OD260/280值。1OD=40μg RNA。OD260/280值在1.8-2.0視為純度很高。一般濃在1000ng/ml較準(zhǔn)。濃度太高要稀釋以后再測定。
7. RNA鑒定
甲醛變性瓊脂糖電泳，確定抽提RNA完整性和DNA污染情況。
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