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原代細(xì)胞(primary cell)：是指從機(jī)體的組織(如人組織、小鼠組織、大鼠組織和兔組織等)經(jīng)蛋白酶或其它的方法獲得單個(gè)細(xì)胞并在體外進(jìn)行模擬機(jī)體培養(yǎng)的細(xì)胞，稱(chēng)為原代細(xì)胞。一般認(rèn)為，培養(yǎng)的原代的第1代細(xì)胞和傳代到第10代以?xún)?nèi)的細(xì)胞統(tǒng)稱(chēng)為原代細(xì)胞培養(yǎng)。

原代細(xì)胞的獲取難度大、需要考慮的問(wèn)題多，原代細(xì)胞如何獲??？

原代細(xì)胞的獲取，就是從活體上將組織分解成單個(gè)細(xì)胞再進(jìn)行培養(yǎng)的過(guò)程，且整個(gè)過(guò)程要求無(wú)菌操作。具體要考慮的問(wèn)題有：組織分解的方式，培養(yǎng)的時(shí)間，換液時(shí)間，細(xì)胞狀態(tài)判斷和凍存。

一、組織分解的方式

將組織分解成單個(gè)細(xì)胞的方式目前主要有兩種：酶消化法和組織塊法（針對(duì)貼壁細(xì)胞）。

1. 酶消化法：所用試劑：膠原酶和胰酶。

 膠原酶的選擇：（根據(jù)自己的組織樣本選擇合適的膠原酶是實(shí)驗(yàn)成功的大前提。）

膠原酶的配制：常用的是DMEM進(jìn)行配制，配制好的膠原酶消化液放置在37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱（注意現(xiàn)用現(xiàn)配）。

膠原酶消化時(shí)間：根據(jù)組織特性，消化時(shí)間會(huì)有差異。以小鼠腎細(xì)胞為例，加入膠原酶Ⅰ進(jìn)行消化后，放入37℃培養(yǎng)箱中消化45min~1h左右，期間每隔10min中震蕩一次，知道組織塊幾乎wan全消失為止（若是組織塊剪得非常細(xì)小，時(shí)間可以短一些，30min左右即可）。

培養(yǎng)過(guò)程：注意原代細(xì)胞在培養(yǎng)2天后可能會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞液變黃（橘黃色）的現(xiàn)象，且無(wú)漂浮物，這是正常現(xiàn)象哦，不是污染。這是由于細(xì)胞在貼壁生長(zhǎng)過(guò)程中釋放了CO2和其他物質(zhì)導(dǎo)致培養(yǎng)液PH發(fā)生了改變，所以變黃。

2. 組織塊法

取材：取組織中間部位，剪成大小均勻的小方塊（1~4mm²），清洗干凈后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)皿中各組織塊要排列均勻。 

加液：培養(yǎng)液不能浸沒(méi)組織塊，避免組織漂浮。然后培養(yǎng)4h左右加培養(yǎng)液，培養(yǎng)48h后換液。

二、培養(yǎng)時(shí)間

無(wú)論是酶消化法還是組織塊法，取樣后培養(yǎng)時(shí)間最少需要一周以上的時(shí)間，期間可換液或者傳代。

三、換液時(shí)間

無(wú)論酶消化法還是組織塊法，在培養(yǎng)期間需要隨時(shí)關(guān)注細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，需觀察其是否貼壁，是否污染，組織塊法要觀察是否有細(xì)胞遷移出來(lái)。正常情況下48~72h可換液一次。

四、細(xì)胞狀態(tài)判斷

正常貼壁細(xì)胞在培養(yǎng)幾天后，會(huì)逐漸貼滿整個(gè)瓶底或者皿底，有的呈纖維狀，有的呈多邊形。這些細(xì)胞的狀態(tài)比較好，生長(zhǎng)至80%~90%融合就可以傳代啦，傳代一次后的細(xì)胞會(huì)更干凈漂亮。

五、凍存

傳一代后的細(xì)胞（也可以不傳代直接凍存）培養(yǎng)至80%~90%便可凍存起來(lái)供后續(xù)實(shí)驗(yàn)用。

凍存液配制：不同的細(xì)胞可能會(huì)有不同的凍存液配制方案，各實(shí)驗(yàn)室也有自己的凍存方案，

常見(jiàn)的方案有：

a: 10%DMSO+90%的FBS；

b: 10%DMSO+40%FBS+50DMEM；

c: 5%DMSO+45%DMEM+50%FBS 。

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