細(xì)胞鋪板不均勻會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性造成影響，解決這一問題可從實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備、鋪板操作、后續(xù)處理等方面著手：

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
確保細(xì)胞狀態(tài)良好：選用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、活力高且形態(tài)正常的細(xì)胞。比如培養(yǎng) HeLa 細(xì)胞，需定期觀察細(xì)胞形態(tài)，若細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、空泡等異常，應(yīng)及時(shí)調(diào)整培養(yǎng)條件或重新復(fù)蘇細(xì)胞，避免使用狀態(tài)不佳的細(xì)胞進(jìn)行鋪板。
充分重懸細(xì)胞：消化細(xì)胞后，使用合適的培養(yǎng)基輕柔吹打，次數(shù)控制在 10-20 次，使全部細(xì)胞團(tuán)塊分散，形成單細(xì)胞懸液。例如培養(yǎng) 293T 細(xì)胞，消化后用移液器吸取培養(yǎng)基，從培養(yǎng)皿底部緩慢吹打，確保細(xì)胞均勻分散，防止因細(xì)胞聚集導(dǎo)致鋪板不均。
校準(zhǔn)移液器：定期對(duì)移液器進(jìn)行校準(zhǔn)，保證移液體積準(zhǔn)確?？赏ㄟ^稱量移液器吸取的去離子水重量，根據(jù)水在特定溫度下的密度計(jì)算實(shí)際移液體積，與設(shè)定體積對(duì)比，偏差應(yīng)控制在 ±2% 以內(nèi)。例如吸取 100μl 液體，實(shí)際重量應(yīng)在 0.098-0.102g 之間。
檢查培養(yǎng)板質(zhì)量：仔細(xì)檢查培養(yǎng)板，確?？椎灼秸饣?，無變形、劃痕等瑕疵。新購培養(yǎng)板可隨機(jī)抽取幾塊，向各孔加入等量液體，在顯微鏡下觀察液面高度和平整度是否一致。

鋪板操作
采用合適的鋪板方法：
多次移液法：將細(xì)胞懸液按每孔所需體積分多次加入，每次加入后輕微晃動(dòng)培養(yǎng)板。如每孔需加 200μl 細(xì)胞懸液，可先加 100μl，水平輕晃使細(xì)胞初步分布，再補(bǔ)加 100μl，繼續(xù)輕晃，增加細(xì)胞分布均勻性。
之" 字形晃動(dòng)法：加完細(xì)胞懸液后，手持培養(yǎng)板沿 “之" 字形緩慢晃動(dòng)，幅度約 2-3cm，頻率每分鐘 10-15 次，每個(gè)方向晃動(dòng) 2-3 個(gè)來回，促使細(xì)胞均勻分布在孔底。
控制加樣速度：加樣時(shí)移液器吸頭貼近孔壁，緩慢勻速將細(xì)胞懸液放出，速度控制在每秒 10-15μl，避免液體沖擊孔底導(dǎo)致細(xì)胞分布不均。
保持環(huán)境穩(wěn)定：鋪板過程在溫度（37±1）℃、相對(duì)濕度 70%-80% 的超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，減少溫度、濕度變化對(duì)細(xì)胞懸液的影響。

后續(xù)處理
避免過度振動(dòng)：鋪板后將培養(yǎng)板平穩(wěn)放入培養(yǎng)箱，避免碰撞、振動(dòng)，防止已初步分布的細(xì)胞重新聚集。
進(jìn)行預(yù)平衡：將鋪好細(xì)胞的培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)放置 15-30 分鐘，使細(xì)胞初步貼壁，再進(jìn)行后續(xù)操作，有助于細(xì)胞均勻分布。

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