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多潛能干細(xì)胞的誘導(dǎo)

時間：2022/12/2閱讀：1402
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簡介

 

多潛能干細(xì)胞（in-duced pluripotent stem cells，iPS）技術(shù)不僅可以解決胚胎干細(xì)胞來源引起的倫理問題，而且自體 iPS 細(xì)胞可以避免異體來源胚胎干細(xì)胞移植引起的免疫排斥反應(yīng)。目前就成體細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生 iPS 細(xì)胞相關(guān)的幾種轉(zhuǎn)錄因子以及誘導(dǎo)方法、如何提高誘導(dǎo)產(chǎn)生 iPS 細(xì)胞的效率以及 iPS 細(xì)胞臨床應(yīng)用方面都是在 Yamanaka 報道的誘導(dǎo)方案基礎(chǔ)上的改良。

 

原理

 

Yamanaka 法誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的原理是把 Oct3/4，Sox2、c-Myc 和 Klf4 這四種轉(zhuǎn)錄因子基因克隆入病毒載體，然后引入小鼠成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)其發(fā)生轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生的 iPS 細(xì)胞在形態(tài)、基因和蛋白表達(dá)、表觀遺傳修飾狀態(tài)、細(xì)胞倍增能力、類胚體和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都與胚胎干細(xì)胞相似。

 

 

材料與儀器

 

器材：

① 37 ℃ 水浴鍋

② 一次性無菌培養(yǎng)皿

③ 一次性無菌移液管

④ T75 培養(yǎng)瓶

⑤ 涂有明膠的 6 孔板

⑥ 15 ml 離心管、注射器和針頭

試劑：

 

① 材料：提前制備好的飼養(yǎng)層細(xì)胞

② DMEM 培養(yǎng)基

③ 胎牛血清

④ 谷酰胺

⑤ 非必需氨基酸

⑥ DF12 培養(yǎng)基

 

⑦ 血清替代物
⑧ 谷酰胺＋2-巰基乙酉享溶液
⑨ b-FGF 溶液
⑩ β-巰基乙醇

 

步驟

 

多潛能干細(xì)胞的誘導(dǎo)的基本過程可分為如下幾步：

（一）試劑配制


（1）MEF 培養(yǎng)基的配制 DMEM 培養(yǎng)基，450 ml；胎牛血清（56 ℃ 熱滅活 30 min），50 ml；200 mmol/L-谷酰胺，5 ml；非必需氨基酸，5 ml。將所有組分混合后，用 0.22 μm 濾器過濾除菌，4 ℃ 保存，保持無菌。

（2）胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基的配制 DF12 培養(yǎng)基，200 ml；血清替代物，50 ml；200 mmol/L-谷酰胺＋2-巰基乙酉享溶液，1.25 ml；非必需氨基酸 100x 溶液，2.5 ml；b-FGF 溶液，5 ml。所有組分都加入 250 ml 培養(yǎng)瓶中，用 0.22 μm 濾器過濾除菌。培養(yǎng)基最好在 2 周內(nèi)使用。

 

（3）200 mmol/L-谷酰胺＋2-巰基乙酉享溶液的配制。200 mmol/L-谷酰胺（使用前冷凍保存），5 ml；β-巰基乙醇，7 μl?；靹颉?/div>
（4）b-FGF 的配制。b-FGF，10 μg；0.1％ BSA 無菌，5 ml。溶解后按 0.5 ml 每份分裝，冷凍保存。

（二）開始前準(zhǔn)備


（1）小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的獲得 通過同源重的方法將雙選擇標(biāo)記系統(tǒng)，如βgeo（neo 用于 G418 篩選，βGal 用于顯影）基因盒，同源重組到小鼠 Nanog 基因位點(diǎn)，使βgeo 受內(nèi)源性 Nanog/O）ct 啟動子控制，由于 Nanog 只在 ESC 中表達(dá)，所以來源于 Fbx 158geo / 3gco 小鼠的體細(xì)胞由于缺乏 ES 特性，不能在 G418 中生長。按 MEF 制備方法，從 Fbx15βgeo/βgco 小鼠中分離培養(yǎng) Fbx15βgea/βgeo 來源的 MEF。

（2）經(jīng)典的「Yamanaka」法 OCT4，SOX2，KLF4，C-MYC 病毒的準(zhǔn)備。

（3）MEF 飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備。

（三）細(xì)胞誘導(dǎo)


（1）感染前一天，將處于對數(shù)生長期的 Fbx15 Pgco/βgeo 來源的 MEF 細(xì)胞鋪于 6 孔培養(yǎng)板，使感染時細(xì)胞達(dá)到 80％ 的匯合。

（2）按測定的病毒滴度，以 10 個 pfμ/細(xì)胞加入適量濃縮病毒上清，用 MEF 培養(yǎng)基補(bǔ)齊至每個孔 2.5 ml 體積，再加入終濃度為 8 μg/ml 的 polybrene（聚凝胺），混合均勻。

（3）棄去 Fbx15 βgeo/βgco 來源的 MEF 細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，加入上步制備的病毒溶液，6 孔培養(yǎng)板每孔加 2.5 ml 的病毒溶液。37 ℃ 孵育 4 h 到過夜。

 

（4）換新鮮胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基。

（5）感染后 3 d，向培養(yǎng)基中添加終濃度為 0.3 mg/ml 的 G418。

（6）每 2～3 天換新鮮胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基，添加終濃度為 0.3 mg/ml 的 G418，進(jìn)行克隆篩選，持續(xù) 2～3 周。

（7）在培養(yǎng)過程中，觀察克隆形成情況。將其中與 ES 細(xì)胞形狀相似克隆按 ESC 培養(yǎng)方法擴(kuò)增傳代，并進(jìn)行鑒定。

（四）實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析


誘導(dǎo)成功的 iPS 需進(jìn)行多能性的鑒定，鑒定的內(nèi)容包括以下幾方面。

（1）形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

（2）生長特性。

 

（3）發(fā)育潛能：2N 囊胚注射，獲得嵌合體病能通過生殖系遺傳給后代（形成三胚層細(xì)胞并能夠形成配子細(xì)胞遺傳給下一代）；4N 囊胚注射，通過此方法獲得的小鼠，胚外組織來源于 4N 的細(xì)胞，而小鼠則全部來自 iPS 細(xì)胞。

（4）標(biāo)志分子表達(dá)。

（5）表觀遺傳學(xué)特性。

 

 

注意事項

 

（1）目前已經(jīng)報道的轉(zhuǎn)錄因子的組合有很多，在 Yamanaka 四因子基礎(chǔ)上，還報道的組合有 OCT4，SOX2，NANOG 和 LIN28；OCT4，SOX2 和 KLF4；Sox2，c-Myc 和 Klf4；使用前冷凍保存。按 50 ml 分裝后冷凍保存，使用前融化。
（2）目前用于過表達(dá)上述核心轉(zhuǎn)錄因子的手段有很多，包括反轉(zhuǎn)錄病毒載體，腺病毒載體，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，重組蛋白誘導(dǎo)方法，化學(xué)小分子 ［例如 G9a 組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的小分子抑制劑 BIX-01294（BIX）］ 等。
（3）對于提高誘導(dǎo)效率方面，MSC 作為誘導(dǎo)細(xì)胞其誘導(dǎo)成為 iPS 的效率較皮膚來源成纖維細(xì)胞的比率高：組蛋白脫乙酰基酶抑制劑內(nèi)戊酸（VPA）和新報道的維生素- C 能顯著提高 iPS 的誘導(dǎo)比率。
（4）陽性克隆的篩選方法包括報告基因篩選和形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)篩選。報告基因篩選方法是指用基因重組技術(shù)建立具有藥物抗性基因的小鼠成纖維細(xì)胞抗性受內(nèi)源性 nanog 或（）ct4 表達(dá)調(diào)控，通過壓力篩選，表達(dá)耐藥基因的克隆優(yōu)勢生長。

 

 

以上就是本期的內(nèi)容，更多資訊，歡迎點(diǎn)擊安培生物網(wǎng)站鏈接了解更多技術(shù)與產(chǎn)品資訊。

 

安培生物科技有限公司介紹：

安培生物堅持為生命科學(xué)研究、活體動物轉(zhuǎn)染、大規(guī)模生物生產(chǎn)、基因和細(xì)胞治療領(lǐng)域客戶，提供*細(xì)胞體內(nèi)可代謝的核酸轉(zhuǎn)染試劑；inviCELL™Platelet lysate無動物血清產(chǎn)品旨在支持廣泛的細(xì)胞擴(kuò)增和生產(chǎn)，包括培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞和多種免疫細(xì)胞系等，為制藥公司或者生物技術(shù)公司提供無血清細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模生產(chǎn)服務(wù)；提供以植物生物為平臺基因序列全人源化、*的細(xì)胞培養(yǎng)可分解3D基質(zhì)膠產(chǎn)品；提供內(nèi)毒素≦ 1.0 EU/mL、對細(xì)胞無毒性影響、高純度的一型膠原蛋白產(chǎn)品。安培生物專注為生物醫(yī)藥領(lǐng)域提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品和技術(shù)服務(wù)，努力發(fā)展為基因治療、細(xì)胞治療的生物科技企業(yè)

 

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