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怎樣用酶標儀檢測氟喹諾酮
一、概要：
氟喹諾酮類（FQNS）又稱吡酮酸類或吡啶酮酸類，是一類十分重要的廣譜抗生素藥物，能抑制細菌DNA螺旋酶。其常在牛、豬和雞等家禽養(yǎng)殖中被作為獸藥使用。特別是雞、豬和魚/蝦等的養(yǎng)殖企業(yè)均使用其來防治家禽傳染病已成為獸醫(yī)臨診和水產(chǎn)養(yǎng)殖中重要的抗感染藥物之一，由于其耐藥性和潛在的致癌性引起廣泛的關(guān)注。歐盟理事會條例中對部分氟喹諾酮類藥物的大*值MRL作出了明確的規(guī)定。
二、試驗原理
采用間接競爭ELISA方法，在酶標板微孔條上預(yù)包被氟喹諾酮類抗原，樣品中殘留的氟喹諾酮類藥物和微孔條上預(yù)包被的抗原競爭抗氟喹諾酮類抗體，加入酶標二抗后，經(jīng)TMB底物顯色，樣品的吸光值與其殘留物氟喹諾酮類藥物的含量成負相關(guān)，與標準曲線比較再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中殘留物氟喹諾酮類藥物的含量。
三、使用范圍：
可定性、定量檢測肌肉、肝臟、牛奶、奶粉等樣品中氟喹諾酮類藥物的殘留量。
四、使用設(shè)備及試劑
……酶標儀 450nm/630nm
……離心機
……均質(zhì)器
……氮吹儀或旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器
……洗耳球
……聚苯乙烯離心管：10mL、50mL
……微量移液器20μL～200μL，100μL～1000μL
……刻度移液管
……天平：感量0.01g
試劑：
……甲醇 （分析純）
……二氯甲烷 （分析純）
……正己烷（分析純）
……濃鹽酸
……十二水磷酸氫二鈉（分析純）
……二水磷酸二氫鈉（分析純）
五、檢測步驟：
測定前應(yīng)須知：
1、使用之前將所有試劑和需用板條的溫度回升至室溫（20～25℃）。
2、使用之后立即將所有試劑放回2～8℃。
3、在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。
4、在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜封住微孔板。
操作步驟：
1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫（20～25℃）回溫30min以上，注意每種液體試劑使用前均需輕輕搖勻。
2、取出所需數(shù)量的微孔板，將不用的微孔放入帶有干燥劑的錫箔袋中，保存于2～8℃。
3、洗滌工作液在使用前也需回溫。
4、編號：將樣品和標準品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣品和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣品孔所在的位置。
5、加標準品/樣品：加標準品/樣品50ul/孔到對應(yīng)的微孔中，然后加入抗試劑50ul/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)15min。
6、洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液250ul/孔，充分洗滌4～5次，每次間隔10～20s，用吸水紙拍干（拍干后若有氣泡可用未使用過的槍頭戳破）。
7、加酶標物：加入酶標物100ul/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)15min，取出重復(fù)洗板步驟6。
8、顯色：加入底物液A液50ul/孔，再加底物液B液50ul/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)10～15min。（如顏色較淺可適當延長此步的反應(yīng)時間）
9、測定：加入終止液50ul/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，請在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測定每孔OD值。