免疫細胞化學3D 生物打印機

概述

免疫細胞化學 （ICC） 是一種實驗室技術，允許使用可在顯微鏡下可視化的選擇性探針檢測細胞中的特定蛋白質或抗原。該方案描述了使用針對特定靶標的一抗和用熒光探針標記的二抗的兩步ICC。以下方案針對由封裝在水凝膠中的細胞組成的3D生物打印樣品進行了調整。

材料

• PBS

• PBS/0.1% Triton-X 溶液

• PBS/0.1% Triton-X/1% 牛血清白蛋白 （BSA）

• 10% 福爾馬林或 4% 多聚甲醛 （PFA）

• DAPI解決方案

• 封固劑

• 硅脂

• 顯微鏡載玻片

• 蓋玻片

方法

1. 小心地從樣品中吸出培養(yǎng)基;

2. 在 PBS x3 中洗滌 1D 生物打印結構 5 分鐘。確保整個結構浸入 PBS 中;

3. 在室溫下用 10% 福爾馬林或 4% PFA 固定 30 分鐘，將構建體浸入固定劑中;

4. 在室溫下用PBS/3.0%Triton-X/1%洗滌1次15分鐘，以透化細胞膜;

5. 將一抗在 PBS/0.1% Triton-X/1% BSA 中稀釋至終濃度的樣品在 4°C 下孵育過夜;

6. 在 PBS/3.15% Triton-X 中洗滌 0 次 1 分鐘;

7. 將樣品與在PBS/0.1%Triton-X/1%BSA中稀釋的二抗在室溫下避光孵育2h;

8. 在室溫下在PBS中洗滌3次15分鐘;

9. 在PBS中將DAPI稀釋至終濃度為0.1μg/ ml至10μg/ ml，并將3D生物打印結構浸入所得溶液中。在避光室溫下孵育 15 分鐘;

10. 在室溫下在PBS中洗滌3次15分鐘;

11. 拿一個顯微鏡載玻片，手動擠出一些硅脂油脂，形成一個比你的3D結構略大的孔（載玻片處理方案);

12. 將您的 3D 生物打印結構移動到顯微鏡載玻片上的硅膠上;

13. 將封固劑加入硅膠孔中，直至填充;

14. 將蓋玻片放在上面并輕輕按壓。硅脂不會是固體，因此請小心執(zhí)行此步驟;

15. 使用選定的方法進行成像。我們建議對 3D 樣品進行共聚焦熒光成像或雙光子顯微鏡。切記將薄蓋玻片靠近顯微鏡物鏡，以獲得更好的成像效果;

警告

根據構建體的厚度、生物材料滲透性和幾何形狀，可能需要增加 ICC 方案的孵育時間。每個孵育時間都可以在振蕩器或軌道振蕩器上進行，以幫助溶液的擴散。

只有當所使用的生物材料不透明并且可以被顯微鏡使用的光穿透時，成像才能正常工作。一些生物材料可能會顯示自發(fā)熒光并干擾成像 - 如果出現(xiàn)此問題，請嘗試選擇合適的濾光片。

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