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介紹選擇流式抗體技巧
閱讀：1105 發(fā)布時間：2022-8-22流式抗體本身也是抗體，所以選擇流式抗體一定要滿足抗體選擇最基本的條件：目標蛋白特異性，反應種屬以及應用實驗。流式抗體能夠在短時間內(nèi)檢測分析或分選大量細胞，在血液學、免疫學、腫瘤學、藥物學等領域中的應用越來越廣泛。其純度、批次穩(wěn)定性、特異性，以及流式結果的可重復性備受重視。
流式抗體熒光標記的方式包括直接標記和間接標記兩種。在流式實驗過程中，盡量減少實驗工序和過程，以保證實驗的真實和準確性。因此在條件允許的范圍內(nèi)，建議盡量用直接標記的抗體進行實驗而不去做間接標記。
隨著流式細胞術的日益發(fā)展，流式抗體及熒光標記產(chǎn)品的種類、數(shù)量也在不斷增多，加上多色分析實驗方案需求的增長，逐漸產(chǎn)生了抗體難選擇、熒光難搭配等問題，如何選擇合適的流式抗體，也成為了流式技術是否能成功的關鍵因素之一。下面介紹選擇流式抗體技巧：
一、滿足抗體具備的基本條件
確定所需檢測的指標，目的細胞的特異性表面標記或胞內(nèi)標記；
根據(jù)檢測樣本的種屬選擇抗體，流式抗體基本無法進行種屬交叉反應；
根據(jù)抗體的說明，明確是否可以用于流式實驗。
二、確定所使用儀器的參數(shù)配置
激光器：不同的流式細胞儀激光器不同，常見的有405nm，488nm和635nm，需要根據(jù)具體的儀器進行確定。
濾光片：檢測通道的多少，決定最多可以同時檢測幾個指標。熒光素的發(fā)射波長與濾光片有關，所選擇熒光素要在儀器的可檢測范圍內(nèi)。
儀器：相同的熒光在不同的儀器上檢測通道可能不同，需要參照儀器的說明。
三、熒光的選擇
熒光有強弱之分，如抗原表達弱或分群不明顯的建議選擇強熒光，如PE、APC；反之，抗原表達強或分群明顯的建議選擇常用的弱熒光例如FITC即可。常用熒光強弱排序程度為：PE>APC>PE-cy5Cy5>PercCPp-Cycy5.5>FITC
四、多色熒光搭配
很多實驗需要同時檢測幾個指標，此時就需要多個熒光標記進行搭配。流式抗體熒光標記搭配主要由3個因素決定的：流式細胞儀能檢測多少個通道、需要同時檢測檢測多少個指標、的抗體有多少種熒光標記。
能檢測多少通道是又激光決定的需要注意所使用的儀器有哪些激光。每個檢測通道只能選擇1種熒光素，各通道之間的熒光素可以隨意搭配，檢測通道不能沖突。
如果需要做多個指標，而流式細胞儀能檢測的通道不夠，首先將指標歸成2類，再將樣本分成2份，分別進行檢測。
所選各種熒光素光譜的重疊應當盡量減少，否則將會導致較大的補償。例如，PE-Ccy5與APC同時標記，將會導致補償過度，需換成PE-Ccy5.5或PerCPcp-Ccy5.5。
五、同型對照抗體
同型對照，是用于消除由于抗體非特異性結合到細胞表面而產(chǎn)生的背景染色，類似于陰性對照，是流式細胞實驗*的一項。
同型對照是使用與一抗相同種屬來源、相同亞型及亞鏈、相同熒光標記的免疫球蛋白，也要求使用相同劑量。如一抗是抗human CD3-FITC(mouse IgG1)，同型對照則為Mouse IgG1-FITC.
如果是純化的一抗加熒光標記的二抗，那么應該選擇與一抗相對應的同型對照抗體，如純化的CD3+PE標記的二抗，則對照為純化的同型對照+ PE標記的二抗。
有時候同型對照的表達會比抗體的表達高，首先檢查同型對照的抗體是否加錯類型、劑量等。其次，因為有些標志在細胞的表面或者胞內(nèi)表達不高，而跟其類似的抗原非常多，那么同型對照非特異性的結合會超過抗體的特異性，所以會造成這種現(xiàn)象。這個時候推薦使用其他陰性對照，如空白對照等。