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劃痕實驗（細胞遷移）的實驗流程詳述
閱讀：376 發(fā)布時間：2024-8-12細胞遷移(Cell migration)：因其類似體外傷口愈合過程，又名傷口愈合實驗(Wound healing assay)，是指細胞在接收到遷移信號或感受到某些物質(zhì)的梯度后而產(chǎn)生的移動。它是一種廣泛建立的研究體外集體細胞遷移的技術(shù)。。細胞劃痕（Wound Healing)是一種操作簡單，經(jīng)濟實惠的研究細胞遷移/腫瘤侵襲的體外試驗方法。
基本原理：在融合的單層細胞上人為制造一個空白區(qū)域，稱為“劃痕/傷口"，劃痕邊緣的細胞會逐漸進入空白區(qū)域使“劃痕/傷口"愈合，于細胞遷移過程中在開始和定期捕獲圖像，通過測量不同時間點的劃痕間距并計算差值，可對細胞的遷移能力做出判斷。
條件好的實驗室可以使用活細胞成像來分析創(chuàng)傷愈合實驗中角質(zhì)形成細胞或者成纖維細胞的遷移活動。結(jié)合包含的軟件分析算法，有可能延遲量化間隙表面關(guān)閉和關(guān)閉推移時間的速度。使用延時顯微鏡獲取數(shù)據(jù)的優(yōu)點是，可以在恒溫箱內(nèi)確定和穩(wěn)定的條件下記錄傷口分析。
通常，用于傷口愈合試驗的細胞類型旨在重建表皮的再生特征。永生化的細胞系和原代細胞經(jīng)常被用作這方面的模型。蕞常用的細胞類型是角質(zhì)形成細胞和成纖維細胞。
實驗前準備：
1.學習：了解實驗的目的、實驗所用試劑耗材、實驗基本操作和注意事項、結(jié)果分析等。
2.耗材：六孔板、馬克筆、直尺、200ul槍頭、PBS、wan全培養(yǎng)基等。
3.規(guī)劃：根據(jù)所用細胞生長速度和所需定點拍照時間提前規(guī)劃實驗。建議在做實驗之前進行一次預實驗。
實驗步驟：
1.劃線：于六孔板底面，馬克筆順直尺畫三條橫線作為標記線。
2.種板：根據(jù)分組種板，細胞密度為5x105個/孔左右。并務必鋪勻。
3.劃痕：待細胞長滿后，用直尺比著，200ul槍頭垂直于孔板和畫的標記線劃兩條垂線，使劃痕與標記線相交，可以形成若干交叉點，作為固定的檢測點。
4.清洗：棄去舊培養(yǎng)基，用PBS輕輕潤洗兩到三次，直到劃下來的細胞沖洗干凈。
5.加液：根據(jù)分組分別加入加藥培養(yǎng)基或無血清培養(yǎng)基。
6.拍照觀察：劃痕、清洗、加液完成后，用顯微鏡拍不同倍數(shù)的照片，作為0h對照。放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在所需時間點取出細胞，于顯微鏡下觀察同一位置劃痕寬度并拍照。
7.數(shù)據(jù)分析：一種是統(tǒng)計細胞遷移的距離，一種是統(tǒng)計劃痕面積。都可以用ImageJ軟件來進行分析。
那么制作劃痕實驗需要注意事項：
1. 細胞的密度；劃痕實驗一般是幾種細胞的結(jié)合，但是每種細胞的生長速度會不一樣，所以需要按照細胞的生長特性調(diào)整培養(yǎng)時間，細胞鋪滿孔底時劃痕的效果會比較好，建議是100%的鋪滿。
2. 用槍頭畫線時盡量垂直，以6孔板為例 ，一個孔可以畫6條線
3. 畫線之后一定要用PBS洗兩次，以去除劃下的細胞
4. 注意培養(yǎng)方式一定要改成無血清或者低血清的培養(yǎng)基，因為：劃痕后用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，意在說明在監(jiān)測的 24 小時內(nèi)，劃痕的縮小是細胞 遷移作用的結(jié)果，所以要將細胞增殖造成細胞遷移的影響降到蕞低；但若細胞改成無血清培養(yǎng)后大面積漂浮，需要適量加入血清濃度不能高于2%。
5. （5）放入37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)?？砂?，10，12，15時間點取樣，拍照(具體時間依實驗需要而定)。
6. （6）統(tǒng)計方法：使用Image J軟件打開圖片后，抓取自己畫的線條，計算細胞間距離的平均值。