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逆轉錄RT-PCR具體操作步驟
閱讀：15618 發(fā)布時間：2021-12-27逆轉錄RT-PCR原理:
提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo(dT)或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。RT-PCR使RNA檢測的靈敏性提高了幾個數(shù)量級，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。
逆轉錄RT-PCR操作步驟：
一、RNA逆轉錄cDNA（反應體系要20ul）依次加入
1、Oligo（dT）加入1ul。
2、RNA（體積即上一步驟計算出來的）
3、剩下的用無Rnase水補齊共12ul 65℃水浴5min。
二、加入逆轉錄試劑
1、5×Reaction Buffer 4ul
2、Ribolock RNase Inhibiter 1ul
3、10mM Dntp mix 2ul
4、RevertAid m-mul URT 1ul
三、設置儀器，按照說明書設置
1、oligodT：42℃ 60min
2、逆轉錄：70℃ 5min
3、終止：4℃
附加：cDNA可以跑電泳看一下，取cDNA 1ul加load buffer（看這個是幾乘的）混勻，跑電泳，marker用2000的取6ul左右膠板的制作，后面有說明。
四、PCR cDNA擴增目的基因（反應體系是20ul，不夠用無菌水補齊）
下面的實驗用高壓過的槍頭和普通高壓過的水即可。（所用以下配比物品都要在冰箱中凍存，使用之前離心，甩下來即可。量大的話可以先加樣配比，即把所需要的試劑總量計算出后，取出放在ep管中。）
1、加樣：①Mix 10ul ②引物 1ul ③cDNA和水總計9ul
2、混勻：小離心機甩一下即可
3、放入PCR儀：PCR儀事先設定條件，反應條件根據(jù)mix說明書來設定
4、PCR產(chǎn)物保存：一般在4℃冰箱保存，長時間不用可-20℃凍存。
五、配膠和跑膠:
1、配膠: （水平膠；瓊脂糖凝膠）要帶手套，TAE有毒。
小膠板8孔的 TAE 25ml 瓊脂糖 0.25～0.30g
中膠板25孔的 TAE 50ml 瓊脂糖 0.50～0.55g
步驟：稱取BIOWEST AGAROSE（瓊脂糖）放入配膠專用燒瓶→用配膠專用量筒量1×TAE倒入燒瓶→酒精燈加熱(以看到冒泡為準)→將沸騰的液體轉移到EB污染區(qū)的燒瓶中→加入EB或EB替代（觀察顏色不是很深即可，一般小膠板3滴左右）→插梳子→倒入電泳槽(倒膠從一個角倒入防止產(chǎn)生氣泡)→待膠凝固30分鐘左右拔出梳子進行跑膠(如不馬上跑將膠放4℃冰箱保存,防止膠變干)。
2、跑膠:
（1）電泳緩沖液用1×TAE,一般跑5-8次膠后就要重新?lián)Q電泳緩沖液。
（2）要讓緩沖液沒過膠。
（3）Marker標記染色體上一個可以被識別的區(qū)域，我們用的是2000的（保存在4℃冰箱中）：3-6ul單格加入。
步驟：取PCR產(chǎn)物（cDNA）8ul，加入單格上，接通電源，跑膠。（注意：跑膠方向是從負極到正極）,當loading Buffer跑到2/3時停止跑膠（大約40分鐘），帶手套取膠放在照相臺上。
六、照相