Ⅱ型肺泡上皮原代細胞

人Ⅱ型肺泡上皮細胞分離自肺組織；肺泡由單層上皮細胞構成的半球狀囊泡。肺中的支氣管經多次反復分枝成無數(shù)細支氣管，它們的末端膨大成囊，囊的四周有很多突出的小囊泡，即為肺泡。小肺泡細胞，又稱I型肺泡細胞，厚約0.1微米，基底部是基底膜，無增殖能力。大肺泡細胞，又稱Ⅱ型肺泡細胞，分泌表面活性物質（二棕櫚酰），以降低肺泡表面張力。Ⅱ型肺泡細胞位于Ⅰ型肺泡細胞之間，數(shù)量較Ⅰ型肺泡細胞多，但覆蓋面積比Ⅰ型肺泡細胞小。細胞立方形或圓形,頂端突入肺泡腔。細胞核圓形，胞質著色淺、呈泡沫狀。電鏡下，細胞游離而有少量微絨毛，胞質內富含線粒體和溶酶體，有較發(fā)達的粗面內質網(wǎng)和高爾基復合體。核上方有較多的分泌顆粒，電子密度高、大小不等，直徑約0.1-1.0μm顆粒內含有平行排列的板層狀結構，稱為嗜餓性板層小體。小體內的主要成分為磷脂，以二棕櫚酰為主，此外還有糖胺多糖及蛋白質等。顆粒內物質釋放出來后，在肺泡表面形成一層粘液層，稱為表面活性物質（surfactant）。表面活性物質有降低肺泡表面張力、穩(wěn)定肺泡大小的作用。呼氣時肺泡縮小，表面活性物質密度增加，表面張力降低，防止肺泡過度塌陷；吸氣時肺泡擴張，表面活性物質密度減小，肺泡回縮力加大，可防止肺泡過度膨脹。表面活性物質的缺乏或變性均可引起肺不張，過度通氣可造成表面活性物質缺乏；吸入毒氣可直接破壞表面活性物質。Ⅱ型肺泡細胞有分裂、增殖并分化為Ⅰ型肺泡細胞的潛能，故具有修復受損傷上皮的作用。

產品名稱：人Ⅱ型肺泡上皮細胞

組織來源：肺組織

產品規(guī)格：5×10?Cells/T25培養(yǎng)瓶

包被條件 鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2）

培養(yǎng)基 含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長特性 貼壁

細胞形態(tài) 上皮細胞樣

傳代特性 可傳1-2代左右

消化液 0.25%

培養(yǎng)條件 氣相：空氣，95%；CO2，5%

方法簡介

公司實驗室分離的人Ⅱ型肺泡上皮采用彈消化法制備而來制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。

質量檢測

公司實驗室分離的人Ⅱ型肺泡上皮經SP-C免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細胞復蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補加適量培養(yǎng)基。

3、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉入液氮罐儲存。

1）復蘇細胞：將含有 1mL 細胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加 入 4mL 培養(yǎng)基混合均 勻。在 1000RPM 條件下離心 4 分鐘，棄去上清液，補 加 1-2mL 培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培 養(yǎng)過夜（或將 細胞懸液加入 10cm 皿中，加入約 8ml 培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并 檢查細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達 80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的 PBS 潤洗細胞 1-2 次。

2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于 37℃培 養(yǎng)箱中消化 1-2 分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分 變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng) 瓶后加少量培養(yǎng)基終止消 化。

3. 按 6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在 1000RPM 條件下離心 4 分 鐘，棄去上清液，補加 1-2mL 培養(yǎng)液后吹勻。

4. 將細胞懸液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

3）細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。下面 T25 瓶為類；

1. 細胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml ，細胞變圓 脫 落后，加入 1ml 含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計數(shù)板計數(shù)。