免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation，Co-IP）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的，用于研究蛋白質(zhì)間相互作用的經(jīng)典方法，是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。
當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來(lái)。如下圖所示，如果用蛋白質(zhì)A的抗體免疫沉淀A，那么與A在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)B也能沉淀下來(lái)。這種方法常用于測(cè)定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。
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免疫共沉淀的操作方法本身較為簡(jiǎn)單，我們abs955 IP/CoIP試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)操作流程有完整說(shuō)明，但為了獲得更好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，相關(guān)的實(shí)驗(yàn)步驟需要根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行優(yōu)化。
1）裂解和洗滌緩沖液
裂解和洗滌緩沖液是維持復(fù)合物形成的關(guān)鍵因素。我們?cè)噭┖信鋫涞腖ysis buffer使用優(yōu)化的非變性裂解緩沖液，許多蛋白間的相互作用將保持完整。一般認(rèn)為含有非離子型洗滌劑的低離子強(qiáng)度緩沖液（即<120mM NaCl）不太可能破壞蛋白間的相互作用。另外應(yīng)避免在洗滌期間用超聲或渦旋處理的方法裂解細(xì)胞、裂解物或珠子結(jié)合的免疫復(fù)合物，以防止破壞復(fù)合物間的相互作用。離心過(guò)程中應(yīng)輕柔處理樣品以確保減少?gòu)?fù)合物的損失。
2）固相支持物beads的選擇
用于免疫共沉淀的固相支持物一般有瓊脂糖珠和磁珠兩種。瓊脂糖珠由于其多孔表面、通常具有更高的結(jié)合能力，而磁珠在有條件的實(shí)驗(yàn)室操作相對(duì)更簡(jiǎn)便。我們的試劑盒配備優(yōu)質(zhì)Protein A/G 瓊脂糖珠，有效性經(jīng)開(kāi)發(fā)試驗(yàn)充分驗(yàn)證。
3）非特異性作用的高背景
由于細(xì)胞裂解物中存在大量蛋白質(zhì)，因此在操作過(guò)程中可能會(huì)發(fā)生與目標(biāo)復(fù)合物的非特異性結(jié)合。這些非特異性相互作用一般通過(guò)*清洗珠子結(jié)合的免疫復(fù)合物來(lái)打破，但也可以應(yīng)用其他策略來(lái)優(yōu)化非特異性結(jié)合，例如：
(1)、通過(guò)將鹽濃度從120mM滴定至1000mM來(lái)改變緩沖液的離子強(qiáng)度
(2)、減少一抗的使用量，直到信號(hào)干擾比大化
(3)、參考我們推薦的操作步驟，進(jìn)行細(xì)胞裂解物預(yù)清除（可選步驟）
4）抗體污染（IgG交叉反應(yīng)）的優(yōu)化
免疫共沉淀Co-IP中常遇到的問(wèn)題是在WB分析中來(lái)自抗體IgG條帶的干擾，IgG的輕重鏈在25kD和50kD左右，并且在SDS-PAGE中可能會(huì)有<5kD的偏移。針對(duì)這種情況可以采用以下幾種方法進(jìn)行優(yōu)化：
(1)、IP和WB采用不同來(lái)源抗體，IP為鼠源則WB可以選用兔抗。
(2)、采用特異性識(shí)別IgG輕鏈或者重鏈的二抗，如目的蛋白與IgG輕鏈接近、則可采用重鏈二抗。
(3)、運(yùn)用交聯(lián)劑將IP抗體和Protein A/G -Beads交聯(lián)，通過(guò)添加不含巰基乙醇的加樣緩沖液處理目的蛋白-抗體- (4)、Protein A/G-beads復(fù)合物，后離心去除復(fù)合物，上清中只留下目的蛋白。
(5)、將常用的融合標(biāo)簽摻入用于Co-IP主要靶蛋白中時(shí)，預(yù)固定的抗融合標(biāo)簽抗體可用于蛋白質(zhì)復(fù)合物純化。
WB分析前，可以考慮采用低pH洗脫來(lái)代替煮沸，低pH值（2-3）可以降低抗原/抗體相互作用、從而將抗原和抗體分離（如1M甘氨酸緩沖液，pH 2-3），注意電泳前需平衡pH。
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