ELISA（免疫酶聯(lián)吸附實驗）是免疫學(xué)基礎(chǔ)實驗之一，大部分生命科學(xué)領(lǐng)域的科研工作者對其都不陌生。因為其特異性強，靈敏度高，可精確定量的特性，在基礎(chǔ)科研和臨床診斷中，ELISA技術(shù)都應(yīng)用廣泛，相信很多關(guān)注我們的小伙伴也都做過ELISA。
ELISA實驗步驟少，流程短，購買的即用型試劑盒也都有指導(dǎo)性很強的操作說明書，單次實驗3-6小時即可得到結(jié)果，實驗小白也可以很快的上手。但是，各位同學(xué)可不要輕視哦，ELISA和WB、IHC等基礎(chǔ)免疫實驗一樣，都是易學(xué)難精，上手容易，但想要得到穩(wěn)定的結(jié)果，還是要花一點心思的。小編在這里匯總了一些做ELISA的客戶咨詢我們的問題，把其中有代表性的集中做成了FAQ，大家快看看這其中有沒有困擾你ELISA實驗的問題吧~
Q: ELISA可以檢測胞內(nèi)蛋白么？
A: 可以的，大部分ELISA指標(biāo)均為炎癥因子、趨化因子等分泌類型蛋白，支持的樣本類型也多為血清、血漿、細胞培養(yǎng)上清等液體樣本。如需檢測胞內(nèi)蛋白，首先需要確認(rèn)待測指標(biāo)是否在胞內(nèi)表達，然后選用支持組織勻漿樣本的ELISA試劑盒即可，將組織樣品或細胞樣品進行裂解，提取胞內(nèi)蛋白后進行蛋白定量，保證每孔上樣總蛋白量一致即可。
Q: ELISA可以測DNA的表觀么？
A: 不可以，ELISA是利用免疫學(xué)原理，定量檢測蛋白質(zhì)表達的技術(shù)。測DNA表觀遺傳學(xué)，主要是檢測DNA甲基化，可以選用ChIP技術(shù)。
Q: 夾心法ELISA實驗中的捕獲抗體和檢測抗體是同一個抗體么？
A: 不是的，在雙抗夾心法ELISA實驗中，會同時用到捕獲抗體和檢測抗體，這兩個抗體是針對同一抗原蛋白的不同抗原位點的兩種抗體，這樣才可以同時結(jié)合抗原分子。這也是雙抗夾心法ELISA不適用與小分子抗原和半抗原等待測指標(biāo)的原因。
Q: 試劑盒里面有捕獲抗體么？
A: 即用型ELISA試劑盒中，捕獲抗體已經(jīng)預(yù)包被至試劑盒中的ELISA板上，沒有單獨的捕獲抗體提供，直接使用ELISA板孵育稀釋后的樣本及標(biāo)準(zhǔn)品即可。非即用型的ELISA試劑盒會有捕獲抗體提供，需按照說明書推薦的工作濃度，用稀釋液稀釋后自行包被。
Q: 捕獲抗體如何包被在96孔板上？
A: 如果選用的是即用型ELISA試劑盒，無需進行抗體包被，因為試劑盒中的檢測抗體已經(jīng)事先包被在檢測板中；如果是非即用型的ELISA試劑盒，需要自己在實驗前提前進行抗體包被，簡要步驟入下：首先，要選擇ELIS*別的板子，材質(zhì)應(yīng)為聚苯乙烯；然后用抗體包被液將捕獲抗體稀釋（pH9.6的碳酸鹽緩沖液或pH7.2的PBS或pH7-8的Tris-HCl）成工作濃度，再每孔加100 μl（96孔板加樣量）稀釋后的捕獲抗體，室溫或4℃過夜包被，然后進行洗板和封閉之后再次洗板即可使用，如需長期保存，則需要真空凍干后保存。
Q: ELISA實驗中，酶標(biāo)抗體是什么抗體？識別的目標(biāo)又是什么？
A: 這個問題需要具體分析，在直接法ELISA中，酶標(biāo)抗體直接識別抗原，即可檢測，但缺少二抗放大，且靈敏性不高。在間接法ELISA中，酶標(biāo)抗體作為二抗，識別檢測抗體。而在目前應(yīng)用廣泛的雙抗夾心法ELISA中，酶標(biāo)抗體識別的也是檢測抗體，對檢測抗體進行識別和酶標(biāo)記。
Q: 試劑盒有推薦樣本稀釋濃度還需要自己測嗎？
A: 試劑盒一般會給出不同樣品類型的的推薦稀釋比例，但是為大致范圍，比較好還是根據(jù)自己的樣本情況，設(shè)計預(yù)實驗測量計算。尤其是待測蛋白為炎癥因子時，因為在不同組別樣本間差異巨大，更是需要預(yù)實驗檢測后稀釋。
Q: 做實驗前怎么知道待測血清中炎癥因子的范圍呢？多大是高多小是低？
A: 需要根據(jù)文獻推測，一般在健康人樣本中，炎癥因子表達很低，接近ELISA檢測下限，樣品無需稀釋或1:1稀釋即可，如已知為炎癥疾病或造模樣本，可參考文獻，在預(yù)實驗中設(shè)置1:10-100（或更高）的稀釋比例，預(yù)實驗檢測后確定濃度進行正式實驗。
Q: ELISA實驗中，檢測計算抗原的濃度，臨界值怎么確定？
A: 根據(jù)曲線測定的濃度，建議落在標(biāo)準(zhǔn)曲線的中間位置較好，極限一般不要超過標(biāo)準(zhǔn)曲線的上下限，如果超出較多，會影響計算結(jié)果準(zhǔn)確性，建議調(diào)整稀釋比例。
Q: 配好的抗體沒用完如何保存，可保存多久？預(yù)實驗用了一個試劑盒里面的部分板子和試劑，剩下的板子和試劑還能繼續(xù)用于正式實驗嗎？
A: 針對愛必信的ELISA試劑盒來講，在說明書中有各組分拆開后的保質(zhì)期，配好的母液和拆封的板子，可以在四度保存，保質(zhì)期為一個月左右。剩下的板子和試劑在保質(zhì)期內(nèi)是可以繼續(xù)用于正式實驗的，為保證實驗質(zhì)量，還是建議間隔時間不要太長，一周之內(nèi)更好，需注意試劑避免污染，板子保持干燥。
篇幅所限，小編在這里先放上關(guān)于ELISA原理、樣本和預(yù)實驗的10個問題，后續(xù)實驗操作及數(shù)據(jù)分析方面的問題會在接下來的文章中分享，感興趣的小伙伴們繼續(xù)關(guān)注吧~
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