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上海申知心生物科技有限公司
主營產(chǎn)品： 高血脂癥動物模型,心血管疾病動物模型,缺血性心臟病動物模型 |
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質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)原理:
轉(zhuǎn)染類型：根據(jù)不同的實驗?zāi)康?，外源DNA導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞又可分為瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。瞬時轉(zhuǎn)染一般是指外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，存在于游離的載體上，不整合到染色體，在外源DNA導(dǎo)入細(xì)胞1—4天后收獲轉(zhuǎn)染細(xì)胞對轉(zhuǎn)染基因的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制進(jìn)行分析。而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染則需要使外源基因整合于細(xì)胞染色體從而得到穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。實現(xiàn)細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，通常需要一個抗生素篩選的過程。除DEAE葡聚糖只能用于瞬時轉(zhuǎn)染，其他方法均可用于瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。
因為不同的細(xì)胞在生理代謝及分裂上均存在差異，因此研究者將外源遺傳物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞的過程中需要選擇不同的方式。目前，將外源物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞的方法主要分為三大類：1、脂質(zhì)體（或是脂質(zhì)體替代物）轉(zhuǎn)染；2、電轉(zhuǎn)；3、病毒感染。這三種方法互有優(yōu)劣。脂質(zhì)體或是脂質(zhì)體替代物轉(zhuǎn)染操作簡便，價格低廉，但是對細(xì)胞毒性大。而且，有些細(xì)胞通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率很低；電轉(zhuǎn)操作方便快捷，但是需要專門的儀器，對細(xì)胞損傷也比較大；病毒感染克服了前兩者的劣勢，感染效率高，對細(xì)胞毒性小，但是病毒前期包裝需要大量的時間和精力 。
實驗步驟：
1. 轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備
① 將400ul去核酸酶水加入管中，震蕩10秒鐘，溶解脂狀物。
② 震蕩后將試劑放在－20攝氏度保存，使用前還需震蕩。
2. 選擇合適的混合比例(1：1－1：2/脂質(zhì)體[1] 體積：DNA質(zhì)量)來轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在一個轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無血清培養(yǎng)基。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑，再次震蕩。
3. 將混合液在室溫放置10―15分鐘。
4. 吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。
5. 加入混合液，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個小時。
6. 到時后，根據(jù)細(xì)胞種類決定是否移除混合液，之后加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24－48小時。
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