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產(chǎn)品名稱

產(chǎn)品描述

qPCR實時熒光定量預(yù)混液是2×實時定量PCR擴增的預(yù)混合溶液。采用的抗體法熱啟動DNA聚合酶（貨號：10113），在預(yù)變性溫度（95℃）加熱30 sec，UNICON® Taq抗體失活，釋放出Taq DNA Polymerase活性?？贵w法熱啟動Taq酶可以有效抑制引物非特異性退火導(dǎo)致的擴增。同時，配方優(yōu)化了有效抑制非特異性PCR擴增的因子和提升PCR反應(yīng)擴增效率的因子，適合低濃度模板的擴增，使定量PCR可以在寬廣的定量區(qū)域內(nèi)獲得良好的標準曲線。

Mix中含有Hieff® Taq DNA Polymerase、UNICON® Taq抗體、SYBR Green I、dNTPs、Mg2+。使用時，僅需在擴增體系中加入模板和引物即可進行實時熒光定量PCR，大大簡化操作過程，降低污染幾率。

運輸與保存方式

冰袋運輸。-20℃避光儲存，有效期18個月。

本品避免反復(fù)凍融。產(chǎn)品中含有熒光染料SYBR Green I，保存或配制反應(yīng)體系時需避免強光照射。

注意事項

1. 解凍后Master Mix可能出現(xiàn)絮狀物質(zhì)，4℃放置并上下顛倒混勻至溶液澄清，不影響試劑性能。

2. 推薦使用本公司cDNA合成試劑盒（貨號：11123ES），以有效去除RNA樣品中殘留的基因組。

3. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。
4. 本產(chǎn)品僅作科研用途!

反應(yīng)體系（推薦冰上配制）

【注】：使用前務(wù)必充分混勻，避免劇烈震蕩產(chǎn)生過多氣泡。

a) 引物濃度：通常引物終濃度為0.2 μM，也可以根據(jù)情況在0.1-1.0 μM之間進行調(diào)整。

b) 模板濃度：如模板類型為未稀釋cDNA原液，使用體積不應(yīng)超過qPCR反應(yīng)總體積的1/10。

c) 模板稀釋：cDNA原液建議5-10倍稀釋，最佳模板加入量以擴增得到的CT值在20-30個循環(huán)為好。

d) 反應(yīng)體系：推薦使用20 μl或50 μl，以保證目的基因擴增的有效性和重復(fù)性。

e) 體系配制：請于超凈工作臺內(nèi)配制，并使用無核酸酶殘留的槍頭、反應(yīng)管；推薦使用帶濾芯的槍頭。避免交叉污染和氣溶膠污染。

擴增程序（兩步法）                            擴增程序（三步法）

【注】：

高特異性可選擇兩步法，高效率擴增可選擇三步法。

a) 預(yù)變性時間：本反應(yīng)條件適合大多數(shù)基因擴增，如果遇到含有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的基因可適當增加預(yù)變性時間至3-5 min。

b) 退火溫度和時間：請根據(jù)引物和目的基因的長度進行調(diào)整。

c) 熒光信號采集（★）：請按照儀器使用說明書要求進行實驗程序設(shè)置，幾種常見儀器的時間設(shè)定如下：

30sec以上：Applied Biosystems: StepOne , StepOne Plus, 7500 Fast；Roche Applied Science: LightCycler 480；Bio-Rad: CFX96

31sec以上：Applied Biosystems: 7300

34sec以上：Applied Biosystems: 7500

d) 熔解曲線：通常情況下可以使用儀器默認程序。

結(jié)果分析

定量實驗至少需要三個生物學(xué)重復(fù)。反應(yīng)結(jié)束后需要確認擴增曲線及熔解曲線。

1) 擴增曲線：標準擴增曲線為S型。

Ct值落在20-30之間時，定量分析最準確；

Ct值小于10，需要將稀釋模板后，重新進行實驗；

Ct值介于30-35之間時，需要提高模板濃度，或者增大反應(yīng)體系的體積，以提高擴增效率，保證結(jié)果分析的準確性；

Ct值大于35時，檢測結(jié)果無法定量分析基因的表達量，但可用于定性分析。

2) 熔解曲線：

熔解曲線單峰，表明反應(yīng)特異性好可以進行定量結(jié)果分析；若熔解曲線出現(xiàn)雙峰或者多峰，則不能進行定量分析。

熔解曲線出現(xiàn)雙峰，需要通過DNA瓊脂糖凝膠電泳判斷非目標峰是引物二聚體還是非特異性擴增。

如果是引物二聚體，建議降低引物濃度，或者重新設(shè)計擴增效率高的引物。

如果是非特異性擴增，請?zhí)岣咄嘶饻囟?，或者重新設(shè)計更高特異性的引物。

引物設(shè)計指南

1）推薦引物長度25 bp左右。擴增產(chǎn)物長度150 bp為佳，不要低于100 bp，可以在100 bp-300 bp內(nèi)選擇。

2）正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超過2℃。引物Tm值60℃-65℃為佳。

3） 引物堿基分布要均勻，避免出現(xiàn)連續(xù)的4個相同堿基，GC含量控制在50%左右。3’端最后一個堿基最好為G或C。

4）引物內(nèi)部或者正反兩條引物間最好避免出現(xiàn)有3個堿基以上的互補序列。

5）引物特異性需要用NCBI BLAST程序進行核對。避免引物3’端有2個堿基以上的非特異性互補。

6）設(shè)計完成的引物需要進行擴增效率的檢測，只有具備相同擴增效率的引物才可用于定量比較分析。

適用機型

Bio-Rad: CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon, Opticon 2, Chromo4;

Eppendorf: Mastercycler ep realplex, realplex 2 s;

Qiagen: Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000;

Roche Applied Science: LightCycler 480, LightCycler 2.0; Lightcycler 96;

Thermo Scientific: PikoReal Cycler; Cepheid: SmartCycler; Illumina: Eco qPCR.

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