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據(jù)估計(jì)，范圍內(nèi)，每年由于使用缺乏驗(yàn)證的抗體而造成的研究經(jīng)費(fèi)損失約為8億美元。為滿足在抗體特異性、功能性和重復(fù)性上的迫切需求，抗體驗(yàn)證工作組（IWGAV）上個(gè)月在Nature Methods上發(fā)表了首篇關(guān)于驗(yàn)證抗體特異性策略的提議。那么，該提議的具體內(nèi)容是什么？有何意義？研究人員和抗體生產(chǎn)商又該如何做呢？近日，生物探索記者采訪了IWGAV主席Mathias Uhlén博士。他說(shuō)：“驗(yàn)證抗體特異性是目前確?？贵w持續(xù)可重復(fù)性zui重要的步驟。”

Mathias Uhlén 博士

    抗體是生物學(xué)研究中的zui常用的一種工具，廣泛應(yīng)用于與免疫檢測(cè)相關(guān)的研究技術(shù)中，包括酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)、免疫印跡、免疫沉淀和免疫組化等。同時(shí)，抗體也是臨床監(jiān)控的重要工具，可用于相關(guān)的診斷和治療。

 

    然而，近年來(lái)，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)，抗體相關(guān)研究一直存在嚴(yán)重的“重現(xiàn)危機(jī)”。研究使用的抗體在質(zhì)量和性能一致性方面存在巨大的差異，對(duì)生物醫(yī)學(xué)研究的可重復(fù)性造成了顯著的不良影響。

 

    想要改善這一困境，加強(qiáng)抗體驗(yàn)證是zui有效的途徑之一。然而，遺憾的是，很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)，業(yè)界都沒(méi)能建立全面、統(tǒng)一、規(guī)范的驗(yàn)證策略和科學(xué)框架。許多研究者呼吁出臺(tái)相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)，以確保抗體在特異性和質(zhì)量上的一致性。

 

    9月5日，抗體驗(yàn)證工作組（International Working Group for Antibody Validation，IWGAV）在Nature Methods上發(fā)表了首篇關(guān)于驗(yàn)證抗體特異性策略的提議，確定了五大“支柱策略”（具體如下），用以指導(dǎo)特定應(yīng)用中的抗體驗(yàn)證。

 

1.基因策略：利用CRISPR/Cas或RNAi等技術(shù)，將對(duì)照細(xì)胞或組織中的目標(biāo)基因敲除或敲低，并檢測(cè)這些對(duì)照細(xì)胞或組織中的相關(guān)信號(hào)。

 

2.正交策略：使用非抗體依賴方法對(duì)大量樣品進(jìn)行定量，并檢測(cè)基于抗體和非抗體定量間的相關(guān)性。

 

3.獨(dú)立抗體策略：使用2種或多種可識(shí)別目標(biāo)蛋白表面不同抗原決定簇的獨(dú)立抗體，并通過(guò)對(duì)比或定量分析確定特異性。

 

4.標(biāo)簽蛋白的表達(dá)：為內(nèi)源性目標(biāo)基因添加親和標(biāo)簽或熒光蛋白標(biāo)簽，利用抗體檢測(cè)方法可對(duì)來(lái)自標(biāo)簽蛋白的信號(hào)進(jìn)行校正。

 

5.免疫捕獲及質(zhì)譜分析（MS）：免疫沉淀（IP）技術(shù)可通過(guò)使用與目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合的抗體分離出目標(biāo)蛋白，其與MS分析結(jié)合（IP-MS）可識(shí)別與純化抗體直接發(fā)生相互作用的目標(biāo)蛋白以及可能與目標(biāo)蛋白形成復(fù)合物的蛋白。

 

    對(duì)抗體的驗(yàn)證可以確?？贵w特異性識(shí)別目標(biāo)抗原、性能不受時(shí)間影響，并且zui終所有使用者都可以根據(jù)正確的實(shí)驗(yàn)方案得到相同的結(jié)果。IWGAV提出的這一驗(yàn)證策略初步建議向著驗(yàn)證抗體特異性和實(shí)現(xiàn)研究的可重復(fù)性邁出了堅(jiān)實(shí)的一步。

 

    那么，這些驗(yàn)證策略究竟是如何確定的？根據(jù)這一提議，科研人員和抗體生產(chǎn)商們應(yīng)該如何做？是否需要第三方參與抗體特異性的驗(yàn)證以確保公平性？驗(yàn)證工作帶來(lái)的額外費(fèi)用是否會(huì)影響提議的推廣？近日，IWGAV主席、瑞典斯德哥爾摩*理工學(xué)院微生物學(xué)教授Mathias Uhlén博士接受了生物探索的專訪，并就這些問(wèn)題分享了他的看法。

 

短短1年內(nèi)，IWGAV發(fā)表首篇“驗(yàn)證策略”提議

 

    IWGAV是*家為抗體生產(chǎn)商和使用者制定抗體驗(yàn)證策略的組織，旨在推進(jìn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的建立，幫助解決抗體特異性和可重復(fù)性方面的挑戰(zhàn)。據(jù)了解，賽默飛世爾科技（以下簡(jiǎn)稱賽默飛）為IWGAV的成立提供了資金支持。短短一年內(nèi)，IWGAV發(fā)表了首篇“驗(yàn)證策略”提議。

 

    除Uhlén博士外，上述驗(yàn)證策略是由來(lái)自亞洲、歐洲和北美的多位生物醫(yī)藥研究領(lǐng)域研究者共同參與完成。Uhlén博士認(rèn)為，驗(yàn)證抗體特異性是目前確?？贵w持續(xù)可重復(fù)性zui重要的步驟。他說(shuō)：“這是需要處理的首要問(wèn)題，并且我們可以看到，后續(xù)操作需要依附這一步驟。”

 

    IWGAV建議至少需要使用這幾種支柱策略中的一個(gè)，以表明某一抗體已被充分驗(yàn)證，可用于某一應(yīng)用中。此外，IWGAV還表示，多種策略的結(jié)合使用能夠?yàn)榭贵w特異性提供更加可靠的證據(jù)。

 

    Uhlén博士強(qiáng)調(diào)，以往，業(yè)內(nèi)缺乏檢測(cè)抗體結(jié)合特異性和有效性的*操作規(guī)范，IWGAV創(chuàng)建這些抗體驗(yàn)證策略的主要目的就是用于解決檢測(cè)抗體特異性的難題。在這一年中，IWGAV審視了抗體的用途，并在制訂抗體驗(yàn)證策略時(shí)將其考慮進(jìn)去，zui終制訂出了在不同應(yīng)用中驗(yàn)證抗體特異性的支柱策略。

 

    回顧在這一過(guò)程中遇到的挑戰(zhàn)，Uhlén博士說(shuō)：“在確定支柱策略時(shí)，需要減少我們建議的驗(yàn)證方法的數(shù)量。我們查看了其它特異性驗(yàn)證方法（例如，親和力檢測(cè)、DNA測(cè)序、同型檢測(cè)等），zui終發(fā)現(xiàn)，這些方法終究無(wú)法直接反映抗體的特異性或交叉反應(yīng)性。因此，我們將它們從驗(yàn)證抗體特異性的首要方法中排除了出去。”

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重視抗體特異性驗(yàn)證，推動(dòng)行業(yè)健康發(fā)展

 

    抗體特異性驗(yàn)證對(duì)研究非常重要，并且對(duì)研究共同體中的每一方（包括生產(chǎn)商、使用者以及投資者）都有著重大的影響。缺乏全面系統(tǒng)的、用于確定抗體有效性的*規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)方法，對(duì)于生物醫(yī)藥研究具有嚴(yán)重的潛在危害。未經(jīng)充分驗(yàn)證的抗體有可能帶來(lái)不可靠的研究結(jié)果，甚至產(chǎn)生錯(cuò)誤的結(jié)論，耽誤重要研究進(jìn)展的獲得；此外，還將導(dǎo)致時(shí)間、精力、材料、金錢等資源的浪費(fèi)。

 

    Uhlén博士介紹稱，進(jìn)行抗體驗(yàn)證的關(guān)鍵在于，確?？贵w能特異性識(shí)別其預(yù)期靶標(biāo)，并持續(xù)保持相似的性能，從而讓所有按照既定實(shí)驗(yàn)方案操作的使用者zui終都能獲得相同的結(jié)果。IWGAV提出的這些驗(yàn)證策略是抗體特異性和重復(fù)性驗(yàn)證*的起始步驟。

 

    他說(shuō)：“在抗體供應(yīng)商尚未對(duì)所有抗體進(jìn)行驗(yàn)證，用戶沒(méi)有現(xiàn)成的驗(yàn)證數(shù)據(jù)可用時(shí)，我建議研究人員要堅(jiān)持使用更多的方法，自己進(jìn)行有效性檢測(cè)和靶標(biāo)鑒定。他們可以在論文中發(fā)布盡可能多的信息，例如，驗(yàn)證抗體特異性的方法、產(chǎn)品貨號(hào)、批號(hào)，可能還要加上資源標(biāo)識(shí)（Resource Identifiers，RRIDs），以確保研究中所使用的試劑（如抗體）可以被無(wú)誤地確認(rèn)來(lái)源。”

 

   “對(duì)于生產(chǎn)商，我建議他們通過(guò)各種現(xiàn)有的技術(shù)（如CRISPR、免疫捕獲加質(zhì)譜分析、標(biāo)簽蛋白表達(dá)、siRNA、獨(dú)立抗體驗(yàn)證和正交策略）驗(yàn)證抗體與靶標(biāo)的結(jié)合，并對(duì)每一新批次的抗體進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證，以確認(rèn)檢測(cè)到的數(shù)據(jù)是否與現(xiàn)有數(shù)據(jù)一致，并具有相關(guān)性。”

 

多方共同參與，制定更完善的抗體“驗(yàn)證策略”

 

    作為IWGAV的資金支持方，在該驗(yàn)證策略發(fā)布不久后，賽默飛承諾會(huì)根據(jù)新的抗體驗(yàn)證策略驗(yàn)證抗體的特異性。這也是在賽默飛所有抗體驗(yàn)證的方法之外，對(duì)抗體特異性驗(yàn)證的完善。據(jù)悉，公司還將在其上用圖標(biāo)或標(biāo)志對(duì)符合新標(biāo)準(zhǔn)的抗體加以標(biāo)識(shí)，以表明其通過(guò)了特異性測(cè)試。

 

    談及賽默飛對(duì)抗體驗(yàn)證工作的大力支持。Uhlén博士說(shuō)：“很高興看賽默飛在其已有抗體驗(yàn)證方法的基礎(chǔ)上，將這些策略指南運(yùn)用于其更多的產(chǎn)品線。IWGAV綜合驗(yàn)證策略的廣泛應(yīng)用需要研究機(jī)構(gòu)、出版方、資助機(jī)構(gòu)和抗體生產(chǎn)商的持續(xù)參與。所有利益相關(guān)方在此提案的采納和實(shí)施中均將發(fā)揮重要作用。”

 

    值得一提的是，對(duì)于使用者和生產(chǎn)商而言，抗體特異性驗(yàn)證必然會(huì)帶來(lái)額外的費(fèi)用。這是否會(huì)影響這一驗(yàn)證策略的推廣和落實(shí)呢？Uhlén博士的答案是否定的。他解釋道：“抗體全面驗(yàn)證策略缺失zui終導(dǎo)致的時(shí)間、精力、材料和金錢的浪費(fèi)，比使用支柱策略帶來(lái)的相關(guān)花費(fèi)要更高。在范圍內(nèi)，每年由于使用缺乏驗(yàn)證的抗體而造成的研究經(jīng)費(fèi)損失大約為8億美元。”

 

    此外，對(duì)于是否需要第三方機(jī)構(gòu)的參與來(lái)保證抗體驗(yàn)證結(jié)果的真實(shí)性，他說(shuō)：“第三方機(jī)構(gòu)參與評(píng)估會(huì)有幫助，但這可能并不是zui切實(shí)際的期望。如果生產(chǎn)商和研究人員都采用合適的支柱策略去驗(yàn)證抗體的有效性，第三方機(jī)構(gòu)就沒(méi)有必要介入了。 ”

結(jié)語(yǔ)

    采訪的zui后，Uhlén博士告訴生物探索記者，除9月份刊發(fā)在Nature Methods上外，他還通過(guò)部分其它重要媒體渠道對(duì)生物醫(yī)藥研究機(jī)構(gòu)詳細(xì)闡述過(guò)這些驗(yàn)證策略，也在抗體生產(chǎn)商和用戶會(huì)議上談?wù)撨^(guò)這一初步提議。“此外，zui近我參加了在美國(guó)舉辦的生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（GBSI）會(huì)議及在中國(guó)臺(tái)灣舉辦的第15屆人類蛋白質(zhì)組組織（HUPO）大會(huì)，會(huì)上，我也向業(yè)內(nèi)人士介紹了這些支柱策略。”他說(shuō)。

 

    IWGAV表示，這份建議將作為建立通用抗體驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)，鼓勵(lì)所有利益相關(guān)方通過(guò)各種渠道給出反饋。Uhlén博士zui后說(shuō)道：“IWGAV希望通過(guò)努力整合業(yè)內(nèi)成員的反饋意見(jiàn)，重新審視這些驗(yàn)證策略，開(kāi)發(fā)出更完善的指導(dǎo)原則。”

 

關(guān)于Mathias Uhlén博士

 

    Uhlén博士于1984年在瑞典斯德哥爾摩的*工學(xué)院獲得博士學(xué)位，1988年成為瑞典*工學(xué)院的微生物學(xué)教授。他的研究主要集中在蛋白質(zhì)科學(xué)、抗體工程和醫(yī)學(xué)，具體內(nèi)容涉及人類和微生物生物學(xué)的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究，包括在癌癥、傳染性疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病和神經(jīng)生物學(xué)中的臨床應(yīng)用。這些研究已經(jīng)產(chǎn)出了超過(guò)550份出版物，目前的H指數(shù)（谷歌學(xué)術(shù)）為98。

 

    Uhlen博士不僅是美國(guó)國(guó)家工程院、瑞典*科學(xué)院、瑞典工程科學(xué)院和歐洲分子生物學(xué)組織的成員，還是歐洲生物技術(shù)聯(lián)合會(huì)的董事長(zhǎng)，并同時(shí)擔(dān)任UniProt科學(xué)咨詢委員會(huì)和IWGAV的主席。自2003年以來(lái)，Uhlén博士領(lǐng)導(dǎo)一個(gè)小組，致力于系統(tǒng)化地描繪人類抗體的蛋白質(zhì)組，創(chuàng)建了開(kāi)放性的Human Protein Atlas（www.proteinatlas。。ｏｒｇ）。